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众所周知,人类许多疾病都是由于基因表达失控所引起的。例如,转录因子的过表达是癌细胞代谢和生长的必要条件。可穿透细胞膜的小分子可以结合到转录因子或者DNA上,通过剪切DNA链或者干扰转录因子-DNA的相互作用,而达到终止异常基因表达的目的。例如,人工金属核酸酶可以通过提取DNA糖环上的氢原子进行有效的DNA链切割,有望成为基因治疗药物的先导。尽管这些核酸酶可以有效切割DNA链,但是它们不具有特异性切割DNA的能力。这一特点是由于核酸酶可以对DNA糖环上的任意氢原子发生氧化还原反应切割。为了改进金属核酸酶对DNA的特异性切割,在DNA识别剂的辅助下,核酸酶可以高效特异性的切割DNA链。天然DNA识别剂(例如锌指蛋白)具有保守的结构和特异性结合DNA的能力。把含铜核酸酶引入到锌指蛋白合适的位置上,可以很好的达到高效剪切DNA链的目的。研究发现,含有吡咯和咪唑的寡聚酰胺小分子可以被设计结合到DNA序列上。同时,寡聚酰胺可以穿透细胞膜,接近染色体,与转录因子竞争性的结合到相应的DNA序列上,有望干扰转录因子与DNA的接触表面,进而影响转录因子与DNA的结合。 本文中,我们重点探测了锌指蛋白辅助下含铜核酸酶提取DNA糖环上氢原子的可能性,以及探测小分子寡聚酰胺如何通过破坏DNA分子的结构影响转录因子与DNA的结合以及对基因的表达调控。另外,我们也研究了MerR家族蛋白(氧化应激蛋白SoxR)不同功能状态间结构转变的过程。本文主要工作总结如下: 1.为了探测在锌指蛋白辅助下,含铜核酸酶提取DNA糖环上氢原子的可能性,我们设计并构建了四个分子模型,把两个含铜化合物[Cu(BPA)]2+(bis(2-pyridylmethyl)amine(BPA))或[Cu(IDB)]2+(N,N-bis(2-benzimidazolylmethyl)aminc(IDB))引入到锌指蛋白Tramtrack(TTK)的Lys69或Lys95残基上,并对这些模型进行分子动力学模拟.我们对模拟轨迹使用MM-PBSA方法进行结合自由能计算,分析底物OOH-末端O原子周围氢原子的径向分布情况以及计算该O原子与糖环上氢原子的距离。模拟结果表明,在30-ns的模拟过程中,含铜化合物可以稳定存在于DNA大沟中。在TTK+[Cu(BPA)OOH]++DNA和TTK+[Cu(IDB)OOH]++DNA体系中,底物OOH-末端的O原子大致接近DNA上的C2H,C3H,C4H或C5H质子,预示提取这些位置的氢原子是可能的,进而为切割DNA链提供了基础。同时分析发现,含铜核酸酶结合锌指蛋白位置的不同也会影响糖环上氢原子的提取能力。同时含铜核酸酶中配体的结构和平面大小对提取DNA糖环上氢原子的类型也有重要影响。 2.近年来,可穿透细胞膜的小分子(如寡聚酰胺)被设计干扰转录因子和DNA的相互作用以及终止异常基因的表达,这一研究越来越受到人们的关注。例如,Dervan教授设计合成Py-Im环型寡聚酰胺与DNA序列结合,同时诱导DNA结构发生改变。进一步他们提出假设,这个环型寡聚酰胺可以作为变构调节剂,破坏DNA构象,进而诱导该DNA分子不再适合与核受体(如糖皮质激素受体GR)结合,达到终止异常基因表达的目的。但是对于寡聚酰胺如何破坏DNA的结构,干扰核受体与DNA分子的结合,至今没有被完全了解。本文中,我们构建分子模型,包括GR-DNA结合域(GRDBD)二聚体+DNA复合物,两个寡聚酰胺+DNA的分子模型,寡聚酰胺+DNA+GRDBD二聚体的三元模型,以及变构的DNA+GRDBD二聚体的二元模型,同时对这些模型执行分子动力学模拟和自由能分析,以此研究当寡聚酰胺结合在DNA小沟时是如何干扰大沟键合的GRDBD与DNA的相互作用的。分析发现,键合在DNA小沟的环型寡聚酰胺分子引起DNA的结构发生了很大的改变,例如与GRDBD二聚体+DNA复合物中的DNA分子相比,DNA的小沟加宽超过4A以及DNA的大沟被压缩也超过4A。对寡聚酰胺+DNA+GRDBD二聚体的三元模型,以及变构的DNA+GRDBD二聚体的二元模型的研究揭示了,被压缩的DNA大沟表面不再适合GRDBD的结合,导致GRDBD远离DNA分子,计算的GRDBD与DNA之间的平均距离从初始的～4A在经过40-ns模拟之后变为～10A。因此,我们的研究简单的揭示了键合在DNA小沟中的寡聚酰胺如何干扰大沟键合的转录因子与DNA的相互作用,最终调节基因表达。 3.MerR家族蛋白是一类调控mer操纵子的转录因子,存在于多种细菌中并对外界信号进行反应。氧化应激蛋白SoxR可以应激外界氧化刺激,激活基因soxS的转录。外界有氧化刺激时,SoxR蛋白激活相应启动子转录,该启动子位于-35和-10反应元件之间并包含20个碱基对的间隔。SoxR结合DNA的前提是相应DNA构象发生弯曲。尽管活化态的SoxR蛋白以及活化态的SoxR蛋白结合DNA复合物的晶体结构已经获得,但是由于抑制态SoxR蛋白(无DNA和蛋白处于还原态)以及抑制态SoxR-DNA的复合物(还原态)晶体结构的缺乏,阻碍了人们进一步理解SoxR蛋白处于不同功能态时的结构特点。本文中,我们构建分子模型,包括活化态的SoxR蛋白(氧化态蛋白),抑制态SoxR蛋白(还原态蛋白),活化态SoxR-DNA的复合物(氧化态复合物)以及抑制态SoxR-DNA的复合物(还原态复合物),并对这些模型进行分子动力学模拟。对模拟结果分别进行DNA螺旋参数分析,SoxR-DNA之间的氢键和VandeWaals作用分析,螺旋夹角分析,DNA结合域之间距离和单体平面夹角计算以及蛋白质域运动情况分析。通过对四个模型中的DNA或蛋白的比较得到,抑制态的SoxR-DNA复合物中的DNA弯曲程度变小。进一步分析得到该DNA构象的改变是由于复合物中SoxR蛋白二聚体构象改变引起的。同时抑制态的SoxR蛋白与抑制态的SoxR-DNA复合物中的蛋白分子差异性也很大。Docking活化态的SoxR蛋白和抑制态的SoxR蛋白结果证明两种SoxR蛋白均可与B-DNA结合,但是只有氧化态的SoxR才具有激活DNA转录的能力。