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目的:miRNAs是一种内源性的,长约22nt的非编码小RNA,通过与靶基因3’UTR互补序列特异性的结合而发挥重要的调控作用。许多文献报道miRNAs对肿瘤的诊断和治疗都有重要意义。以往的研究表明miRNA let-7在肺癌中能明显抑制肿瘤细胞的生长,它可以通过下调原癌基因RAS/c-MYC和HMGA-2的蛋白表达而抑制肿瘤细胞的增殖。但是,let-7a在前列腺癌中的表达情况和作用机制却鲜有研究报道。因此,我们运用体内和体外方法研究let-7a在前列腺癌中的表达情况和它对肿瘤细胞增殖的影响,并验证细胞周期相关转录因子E2F2和CCND2是否是let-7a的靶基因。材料与方法:1.细胞培养与组织收集:人前列腺癌细胞系LNCaP、DU145、PC3及PrEC (前列腺上皮细胞)置于10%胎牛血清中培养;26例前列腺癌及周围正常组织标本来源于西京医院泌尿外科。2.质粒的构建和转染:let-7a用miRNA分离试剂盒扩增及纯化。扩增后的产物克隆进真核表达质粒EcoRI/PstI位点,构建表达质粒pcDNA3-let-7a-GFP。将该质粒转染前列腺癌细胞系PC3并筛选后得到稳定表达let-7a的前列腺癌细胞系PC3-let-7a-GFP及空白对照PC3-GFP。同时用人工合成的let-7a mimics和空白对照(NC)或者let-7a抑制剂let-7a-inhibitor以及空白对照NC inhibitor转染PC3和LNCaP。3.总RNA提取和实时定量反转录PCR:按试剂盒操作提取细胞和组织总RNA,用相应的引物扩增let-7a,CCND2和E2F2。4.细胞活性检测分析:将NC、let-7a、NC inhibitor和let-7a inhibitor转染前列腺癌细胞性PC3和LNCaP,观察5天内细胞的生长情况。与3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐孵育后将细胞溶解于二甲基亚砜中,并以490nm波长测量吸光度。5.软琼脂克隆实验:将离散的PC3-let-7a-GFP和PC3-GFP细胞至于上层铺有0.7%软琼脂的12孔板中,18天后计数集落大于100um的分离到下层含1.2%的软琼脂中的细胞数量。6.细胞周期分析:收集72小时后转染NC、let-7a (mimics)、NC inhibitor和let-7a inhibitor的PC3细胞和LNCaP细胞,用磷酸盐缓冲液洗涤并至于4°C酒精过夜后,重悬于500ul碘化丙啶中。流式细胞仪检测G0-G1期、S期和G2-M中的细胞含量。7.双荧光素酶报告基因分析:用相应的引物扩增E2F2和CCND2的3’UTR,并对其与let-7a的结合位点进行点突变获得变异型的E2F2和CCND2的3’UTR。将E2F2和CCND2的3’UTR分别克隆进表达质粒pGL3中。与pRL-TK,NC、let-7a (mimics)或者pRL-TK,NC inhibitor和let-7a inhibitor共转染HEK293细胞;同时将变异型的E2F2和CCND2的3’UTR分别克隆进表达质粒pGL3中,与pRL-TK,NC、let-7a (mimics)共转染HEK293细胞。检测荧光素酶活性降低情况。8.免疫印迹分析:前列腺癌和周围正常组织蛋白以及转染let-7a和对照的细前列腺癌细胞系行蛋白电泳分离后至置于醋酸纤维膜上分离蛋白。用相应的一抗抗体孵育过夜。继而用相应FITC标记的二抗孵育并洗涤后用远红外成像系统检测E2F2、CCND2、CDK4、K-ras的蛋白含量,β-actin作为内参。9.裸鼠荷瘤实验:各五只裸鼠皮下注射~1×106的PC3-let-7a-GFP细胞或者PC3-GFP细胞,4周后处死裸鼠并观察成瘤情况。对肿瘤标本进行免疫印迹分析E2F2和CCND2的蛋白表达情况。结果:1. let-7a在前列腺癌组织和癌细胞中表达下降。实时定量PCR结果显示对比正常组织,let-7a在前列腺癌组织中的含量下降约43%;对比于正常前列腺上皮细胞PrEC,let-7a的含量在LNCap中下降30%,在PC3和DU-145中下降约50% (* p < 0.05; ** p < 0.01)。2. let-7a抑制肿瘤细胞生长,并诱发细胞周期G0-G1阻滞。转染let-7a质粒后,PC3-let-7a-GFP中let-7a含量增加3倍以上,转染let-7a mimics后PC3细胞中let-7a含量增加10倍以上( p < 0.01),表明转染成功。克隆形成实验结果表明,转染后,细胞克隆形成能力下降40% (p <0.01);而MTT生长曲线提示无论是PC3细胞还是LNCaP细胞,与对照组相比,转染let-7a后细胞生长出现明显抑制(p <0.05);流式细胞周期分析表明转染let-7a后,PC3和LNCaP细胞中G0-G1期细胞含量分别增加约30%和16%;相应S期细胞含量分别减少~50%和20%;而与对照组相比,转染let-7a inhibitor的PC3和LNCaP细胞中G0-G1期细胞含量分别减少约23%和19%;相应S期细胞含量分别增加约33%和25%(* p < 0.05; ** p < 0.01)。3. let-7a直接靶向调控E2F2和CCND2。转染let-7a (mimics)和变异型CCND2或E2F2后的HEK293细胞中荧光素酶活性未见改变;而转染野生型CCND2和E2F2的HEK293细胞中荧光素酶活性分别降低约30%和50% (**p < 0.01)。相对于对照组,转染let-7a inhibitor的HEK293细胞中荧光素酶活性未见明显改变,表明E2F2和CCND2直接受let-7a靶向调控,而HEK293细胞中的let-7a含量对实验无明显影响。4. let-7a抑制E2F2、CCND2 mRNA和蛋白质表达。实时定量PCR提示对比PrEC和正常前列腺组织,E2F2和CCND2的mRNA在前列腺癌细胞系LNCaP、PC3、DU-145和癌组织中表达增加(* p < 0.05; ** p < 0.01);而转染let-7a后,PC3和LNCaP细胞中E2F2和CCND2的mRNA含量明显下调(* p < 0.05; ** p < 0.01)。免疫印迹分析表明转染前后CDK4的蛋白表达量未见明显差异; E2F2和CCND2蛋白含量在前列腺癌组织中表达明显高于对照,而转染let-7a后,前列腺癌细胞系中E2F2和CCND2以及k-ras的蛋白含量明显降低。5. let-7a体内抑制前列腺癌细胞的生长裸鼠荷瘤4周后,肿瘤质量和肿瘤/小鼠体积都有明显差异,转染let-7a的裸鼠肿瘤明显小于对照组(p < 0.01)。肿瘤中E2F2和CCND2蛋白含量都明显减低。结论:1.实时定量PCR结果显示let-7a在前列腺癌组织和癌细胞中表达下降。2.我们成功构建了包含let-7a的表达质粒pcDNA3-let-7a-GFP,转染并成功筛选稳定表达let-7a的前列腺癌细胞PC3-let-7a-GFP。3.转染let-7a后,PC3和LNCaP细胞生长和克隆形成能力受到明显抑制,细胞周期分析发现出现G1/S期阻滞。4.双荧光素酶报告基因检测发现let-7a能与E2F2及CCND2 3’UTR特异性结合,破坏结合位点将导致沉默靶基因的能力减弱;免疫印迹分析发现let-7a下调E2F2及CCND2的蛋白表达。5.裸鼠荷瘤实验证实let-7a能够在体内抑制肿瘤细胞的生长。