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研究背景：卵巢癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，严重威胁妇女生命健康，死亡率居妇科恶性肿瘤首位，五年生存率仅40%左右。由于其发病隐匿，早期缺乏特异性症状与体征及有效的诊断筛查手段，而且容易出现侵袭转移，约70%卵巢癌患者确诊时多为晚期，失去了手术的最佳时期，严重影响卵巢癌患者的预后。究其原因，侵袭和转移是卵巢癌治愈困难的瓶颈所在。因此，目前除了探索卵巢癌早期发现的有效手段外，如何有效控制卵巢癌侵袭和转移成为提高卵巢癌五年生存率的有效策略，也必将为最终控制卵巢癌提供新的方法，因而，也成为当今卵巢癌治疗领域研究的热点问题。乳腺癌转移抑制基因1（breast cancer metastasis suppressor1，BRMS1）是近年发现的肿瘤转移抑制基因，可抑制包括卵巢癌在内的多种肿瘤的侵袭转移。在乳腺癌细胞中已证实，BRMS1通过抑制趋化因子受体4（chemokine receptor4，CXCR4）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表达以及诱导肿瘤生长抑制因子4（inhibitorof growth4，ING4）的表达，从而抑制肿瘤细胞的转移。但由于其作用复杂，在卵巢癌中具体的作用机制尚不清楚。因此，通过研究BRMS1基因对卵巢癌细胞侵袭转移的作用及其机制，为寻求控制卵巢癌侵袭和转移提供新的靶点，并为卵巢癌患者的早期诊断、预后评价和综合治疗奠定理论基础。研究目的：本研究利用RNA干扰技术，构建BRMS1-shRNA真核表达载体并转染OVCAR3细胞，探讨BRMS1基因沉默对卵巢癌细胞粘附、侵袭、迁移和血管形成的作用及可能机制。研究方法：1.高表达BRMS1基因的卵巢癌细胞株的筛选应用Western blot法在蛋白水平上检测4种不同转移潜能人卵巢癌细胞株ES-2、HO-8910、SKOV3和OVCAR3细胞中BRMS1的表达情况。2. BRMS1真核表达载体的构建与鉴定根据前期实验结果筛选出沉默效率最高的siRNA靶序列，设计合成2条互补的靶向BRMS1寡核苷酸序列，另设随机序列作为阴性对照，退火处理后克隆至pGPU6/GFP/Neo载体，构建重组载体BRMS1-shRNA，并通过酶切和测序鉴定。3.细胞转染和阳性克隆的筛选采用脂质体介导法将重组载体转染人卵巢癌细胞，经过G418稳定筛选，获得稳定沉默BRMS1基因的卵巢癌细胞株。采用荧光显微镜观察转染效率，采用荧光定量PCR（Q-PCR）和Western blot法分别从mRNA和蛋白水平检测BRMS1的表达。4.沉默BRMS1基因对卵巢癌细胞转移行为的影响采用黏附实验检测细胞的黏附能力，采用Transwell侵袭实验检测细胞的体外侵袭能力，采用Transwell迁移实验和划痕实验检测细胞的体外迁移能力，采用体外血管形成实验检测细胞的诱导体外血管形成能力。5. BRMS1影响卵巢癌细胞侵袭转移的机制研究采用荧光定量PCR法检测CXCR4mRNA的表达，采用Western blot法检测CXCR4、ING4和IL-6蛋白的表达，初步确定BRMS1基因沉默对细胞转移调控的分子机制；进一步采用凝胶电泳迁移实验（EMSA）探讨BRMS1基因沉默对核转录因子-κB（nuclear factor-κappaB，NF-κB）蛋白与CXCR4启动子结合能力的影响，从而研究肿瘤转移相关基因的调控机理。6.统计学分析应用SPSS16.0软件统计分析。计量资料以±s表示，三组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。结果：1.成功筛选出高表达BRMS1的卵巢癌细胞株：OVCAR3。2.重组载体BRMS1-shRNA经酶切鉴定可以被BamHⅠ切开，位点正确，而不能被PstⅠ切开，进一步测序结果与实验设计合成的pGPU6/GFP/Neo-BRMS1靶向目标序列完全一致，成功构建了pGPU6/GFP/Neo-BRMS1重组质粒。3. BRMS1-shRNA转染卵巢癌OVCAR3细胞，经G418稳定筛选后，Q-PCR和Western blot检测显示，干扰组细胞中BRMS1-mRNA和蛋白表达抑制率分别为85.15%和46.67%，差异有统计学意义（P<0.01），成功构建了稳定沉默BRMS1基因的卵巢癌细胞株。4. BRMS1-shRNA转染卵巢癌细胞后，体外粘附、侵袭、迁移和诱导血管形成能力较对照组明显增强，差异有统计学意义（P<0.05）。5. BRMS1-shRNA转染卵巢癌细胞后，Q-PCR结果显示，CXCR4mRNA表达上调，是空白对照组的1.78倍，差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示，CXCR4和IL-6蛋白在干扰组中表达上调，分别是对照组的1.26倍和1.5倍，而ING4蛋白表达下降，抑制率为30%，差异有统计学意义（P<0.05）。6. EMSA实验证实了OVCAR3细胞中NF-κB蛋白能与CXCR4基因启动子区的DNA结合，BRMS1-shRNA转染卵巢癌细胞后CXCR4基因启动子的转录活性上调。结论：1.成功构建BRMS1-shRNA真核表达载体，可稳定抑制人卵巢癌OVCAR3细胞中BRMS1基因的表达。2.沉默BRMS1基因的表达可明显促进卵巢癌细胞的粘附、侵袭、迁移和诱导血管形成能力。3. BRMS1沉默后，CXCR4和IL-6的表达上调，而ING4表达下调，由此推测上述肿瘤转移相关基因参与BRMS1调控卵巢癌侵袭转移的过程。4. BRMS1基因沉默通过上调包含NF-B结合位点的CXCR4基因启动子的转录活性，从而上调CXCR4的表达，最终促进卵巢癌细胞的转移。