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芒果(Mangifera indica L.)是仅次于香蕉的热带、亚热带水果之一,由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.&Sacc)引起芒果炭疽病是为害芒果最严重的病害之一。关于该病害的研究,在病害症状、病原菌生物学、病害发生规律和防治方法等方面报道较多,但在致病机理及其致病性相关基因方面的报道较少。本实验研究了该菌为调控黑色素合成相关的两个致病基因小柱孢酮脱水酶SCD1基因和羟基萘还原酶基因THR1,在克隆获得了全长序列的基础上,通过插入gfp::hygB替换靶标基因的原理构建了敲除载体,通过转化原生质体、含hygB的SR平板筛选、特异性引物PCR验证获得SCD1基因和THR1基因各3个敲除突变体,测定了表型初步分析了其功能,这对揭示Cgloeosporioides. 的致病机理具有重要的学术价值,也为后续寻求防治该病害的新靶标打下良好的理论基础。主要结果如下:1.获得芒果炭疽病菌小柱孢酮脱水酶基因SCD1全长DNA和cDNA序列参照橡胶树炭疽病菌HBCg01基因组数据,利用同源克隆策略技术,通过PCR和RT-PCR技术,获得SCD1基因DNA和cDNA全长序列,大小分别为1580bp和564bp,起始密码子ATG在第360～362 bp位置,终止密码子TAA在第1153～1155 bp位置,自ATG到TAA的DNA全长796 bp,其中含有1个大小564 bp的开放阅读框,预测编码187个氨基酸,分子量约为21.52 kD,等电点(PI)为5.90,与已提交的香蕉炭疽菌(C. musae)和无花果炭疽菌(C. caricae)(GQ266389.1,GQ266386.1)的小柱孢酮脱水酶基因相似性分别为98%和97%,且含有一个NTF2-like保守结构域。因此推测本试验所获得的SCD1基因为C.gloeosporioides的小柱孢酮脱水酶基因,该序列已提交在GenBank上,登录号为KX 198009.1。2.获得芒果炭疽病菌羟基菜还原酶基因THR1全长DNA和cDNA序列用同样的方法,获得了羟基萘还原酶基因THR1全长的DNA和cDNA序列,大小分别为1682bp和837bp,起始密码子ATG在第483～485bp位置,终止密码子TAA在第1287～1347bp位置,自ATG到TAA的DNA全长898bp,其中包含1个837 bp大小的开放阅读框,编码278个氨基酸残基,分子量约为29.09 kD,等电点(PI)为 7.01,与 C. tofieldiae、西瓜炭疽病菌(C. orbiculare) (KZL72291.1、BAK57420.1)的羟基萘还原酶相似性为92%和90%,且含有一个NADB_Rossmann保守结构域。据此确定本试验获得的THR1基因为预期的羟基萘还原酶基因。3.获得了芒果炭疽病菌小柱孢酮脱水酶基因SCD1和羟基萘还原酶基因THR1敲除突变体应用In-Fusion HD Cloning Kit成功构建了以HygB为选择标记的小柱孢酮脱水酶基因SCD1和羟基萘还原酶基因THR1的敲除载体pA2SCD1GH1和pA2THR1GH1,从该载体上扩增了一段含有gfp::hygB基因的重组片段,采用聚乙醇介导的原生质体转化法转化C. gloeospoioides原生质体,得到了 SCD1和THR1转化子,对所得转化子通过在含潮霉素的SR平板上进行抗性筛选、PCR验证及目标条带测序,确定获得了 SCD1、THR1基因敲除突变体各3个,分别命名为△A2沉SCD1-1～△A2SCD1-3、△A2THR1-1～△42THR1-3.4.分析了芒果炭疽病菌小柱孢酮脱水酶基因突变体△A2SCD1-1和羟基萘还原酶基因敲除突变体△A2THR1-1的表型与野生型相比,突变体△A2SCD1-1的菌落和菌丝的颜色变浅,气生菌丝和分枝数减少,菌丝生长速率、产孢量明显下降,细胞壁降解酶活性和胞内黑色素含量显著下降,不能形成附着胞,对高渗胁迫条件的敏感性增强,对H202的抗性更明显,对一些碳氮源的利用率发生了改变,不能侵染未刺伤的芒果果实和叶片,能侵染刺伤的芒果果实和叶片,但致病力明显低于野生型;突变体△A2THR1-1的表型,除了菌丝分枝及对高渗胁迫条件的敏感性与野生型没有明显差异外,其余表型与△A2SCD1-1相似。由此说明,小柱孢酮脱水酶基因SCD1和羟基萘还原酶基因THR1在C.gloeosporioides中对于菌丝的生长、黑色素的产生、分生孢子和附着胞的形成以及致病力等方面起着重要的调控作用,另外SCD1还调控芒果炭疽菌对渗透胁迫的适应性。