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七鳃鳗系圆口纲无颌类脊椎动物,是脊椎动物中古老的类群,在生物进化和发育中具有重要地位。为在七鳃鳗体内开展基因功能研究,本研究首先开展七鳃鳗人工增养殖和早期发育研究工作,建立七鳃鳗胚胎、仔鱼和幼鱼研究平台。基于七鳃鳗胚胎、仔鱼和幼鱼研究平台,利用吗啉反义寡核苷酸(Morpholino oligonucleotides)和siRNA技术,沉默L-HMGB1、LIP(lampreyimmuneprotein)和VLRB基因,创建七鳃鳗基因操作平台。利用七鳃鳗基因操作平台,沉默L-HMGB1、LIP和VLRB基因,对沉默样本进行转录水平分析,检测基因表达谱变化。参考沉默七鳃鳗L-HMGB1基因转录组数据,选取c-fos、tp63、PSMC5、ef和TLR5基因验证沉默L-HMGB1基因转录组结果。同时在核酸水平和蛋白水平检测沉默L-HMGB1基因和L-HMGB1蛋白挽救胚胎中CDA基因和VLR基因表达量,证明L-HMGB1通过CDA调控VLR表达,为CDA介导VLR基因重排机制提供了参考依据。研究结果如下:1.建立七鳃鳗胚胎、仔鱼和幼鱼研究平台东北七鳃鳗的全长、头长、眼径和眼后头长4个形态性状是影响其体质量的重要性状;日本七鳃鳗的全长、吻长和眼后头长3个形态性状是影响其体质量的重要性状。形态性状对体质量的影响分析为七鳃鳗亲本人工选育以及形态学研究提供参考依据。在繁殖季节,性成熟东北七鳃鳗和日本七鳃鳗显示相似的副性征,并表现出相似的繁殖行为。七鳃鳗雌性和雄性的副性征并不完全相同。七鳃鳗的繁殖生物学研究为七鳃鳗的人工繁殖提供了参考资料。室内人工繁殖结果表明,东北七鳃鳗和日本七鳃鳗的受精率和孵化率无差异(P>0.05)。七鳃鳗人工繁殖技术为七鳃鳗早期发育研究提供技术保障。七鳃鳗的卵裂为全裂类型,在18±1℃水温下,受精卵经卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、头凸期、孵出前期以及孵出期,历时11～12天孵育出仔鱼。初孵仔鱼经过约15天卵黄囊期发育成幼鱼,卵黄囊期仔鱼存在异速生长现象。幼鱼卵黄囊消失,消化道贯通,肠道形成,开始滤食。随幼鱼的发育,幼鱼全长和体质量随月龄的增加而增长,体色随月龄的增加而加深。七鳃鳗早期发育研究为七鳃鳗基因操作平台奠定基础。2.建立七鳃鳗基因操作平台在七鳃鳗胚胎发育中,L-HMGB1、LIP和VLRB基因在胚胎各个发育时期均有表达,但表达水平并不相同。在七鳃鳗幼鱼期和成鱼期,VLRB、VLRC、LIP、C3、C1q、Galectin、Syk、TCRL、CD45、TLR5、TLR7、TLR10、TLR18、CXCR4、CCR9、IL-18R、IL-17R、L-HMGB1、MIF、IL-8、IL-17、c-Rel、AH7、BCL11b、Artemis和 CDA1基因在七鳃鳗体内均有表达,但表达水平并不相同。比较和分析免疫相关基因表达变化对基因功能研究具有重要的意义。采用吗啉反义寡核苷酸技术沉默七鳃鳗中L-HMGB1、LIP和VLRB基因。结果表明,沉默L-HMGB1基因胚胎发育至原肠期时,胚胎发育畸形,畸形胚胎不能进入神经胚期,24h内胚胎死亡。利用实时定量PCR和免疫组化方法检测结果表明L-HMGB1基因表达量下调(P<0.01)。沉默LIP后,胚胎发育正常,在11～12天孵出仔鱼。实时定量PCR方法检测结果表明,LIP基因表达量下调(P<0.01)。沉默VLRB基因后,胚胎发育正常,在11～12天孵出仔鱼。实时定量PCR方法检测结果表明,VLRB基因表达量下调(P<0.05)。采用siRNA技术在七鳃鳗成体脑室中注射L-HMGB1 si RNA,结果表明,注射L-HMGB1 si RNA-1、L-HMGB1 si RNA-2 和 L-HMGB1 si RNA-3 能显著降低L-HMGB1基因表达水平(P<0.05)。3.沉默L-HMGB1、LIP和VLRB基因的转录组分析沉默L-HMGB1基因转录组分析表明,共筛选出2556个显著差异表达基因,共参与232条信号通路;其中在凋亡通路中,其中22个基因表达水平上调,4个基因表达水平下调;13 条代谢通路与凋亡现象相关(如 MAPKsignaling pathway、Hedgehog signaling pathway、AMPKsignalingpathway等)。沉默LIP基因芯片分析结果表明,共筛选出4593个显著差异表达基因,参与240条信号通路,在18条代谢通路中显著富集(如Amyotrophic lateral sclerosis、Ribosome、Tryptophan metabolism 等)。沉默VLR 基因芯片结果表明,共筛选出5006个显著差异表达基因,参与236条信号通路,在8条代谢通路中显著富集(如Ribosome、Ribosome biogenesis in eukaryotes、Rheumatoid arthritis 等)。转录水平分析为基因表达谱与功能间潜在关系及其调控规律提供参考依据。4.沉默L-HMGB1基因胚胎中发育和免疫相关基因变化沉默L-HMGB1基因胚胎中tp63,PSMC5以及ef基因的相对表达量下调(P<0.01);c-fos基因相对表达量上调(P<0.05),与转录组结果一致。沉默七鳃鳗L-HMGB1基因后,CDA1和CDA2基因相对表达量下调(P<0.01),VLRA、VLRB和VLRC基因的相对表达水平下降(P<0.01),VLRB蛋白表达量下降。对沉默L-HMGB1基因胚胎挽救(L-HMGB1 MO和rL-HMGB1蛋白共注射)结果表明,原肠期胚胎发生畸形的比例降低(P<0.01),VLRB蛋白表达上调。结果表明L-HMGB1可能通过CDA调控VLR表达。