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目的:1.表达并纯化较高活性的TRAIL蛋白,优化表达条件。2.观察TRAIL对大肠癌细胞HCT116、SW480和SW620细胞增殖的影响,并对机制进行初步分析。方法:1.TRAIL的表达与纯化。扩大培养含p ET-d-TRAIL质粒的大肠杆菌DH5a,IPTG诱导表达TRAIL蛋白。表达产物经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析纯化。利用MTT法测定纯化产物对大肠癌细胞SW480增殖的影响。分别改变诱导剂IPTG的浓度和诱导时间,从而确定诱导TRAIL的最适条件。在亲和层析过程中采用两种洗脱TRAIL的方式,并改变透析的时间,对比以上条件对TRAIL活性的影响。2.初步分析TRAIL对HCT116、SW480和SW620的增殖的影响。在HCT116、SW480和SW620三种大肠癌细胞中分别加入0、100、200和400mg/ml的TRAIL,培养12 h后,光镜下观察TRAIL对细胞形态的影响;MTT法测定TRAIL对细胞增殖的影响;用western blot检测三种细胞中DR5、caspase-3、caspase-6、caspase-7、caspase-8和XIAP的蛋白表达水平;转染caspase-8质粒至SW620细胞,进一步观察高表达caspase-8的SW620细胞对TRAIL敏感性。结果:1.确定最适诱导条件:TRAIL工程菌在培养4 h后进入对数生长期,在IPTG浓度为0.5 mmol/L条件下37℃诱导6 h,TRAIL的蛋白表达量占总蛋白的比例达到20%。2.纯化出纯度高于95%的可溶性TRAIL蛋白。3.在细胞生长处于对数生长期时分别加入0、100、200和400mg/ml的TRAIL并培养12 h。MTT实验显示HCT116的细胞活力分别为对照组的65%、28%、6%。SW480细胞的活力分别为对照组的85%、65%、42%。SW620的细胞活力分别为对照组的95%、94%、91%。4.Western blot显示HCT116、SW480、SW620中caspase-3、caspase-6、caspase-7和caspase-8的蛋白表达量逐渐降低,DR5的蛋白表达量则逐渐升高,XIAP的表达水平从高到低则依次为SW480、SW620和HCT116。5.SW620细胞转染caspase-8后,在100mg/ml TRAIL作用下,细胞活力降低了33%。结论:1.TRAIL能抑制三种大肠癌细胞的增殖,其抑制效应呈浓度依赖关系。2.三种细胞对TRAIL有不同程度的敏感性。SW620对TRAIL最不敏感;HCT116对TRAIL最敏感;SW480为中度敏感。3.SW620对TRAIL的耐受性可能与caspase-8的表达水平低有关。