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1研究目的用环磷酰胺制备小鼠免疫低下与内分泌紊乱模型,分别给小鼠灌服二至丸、地黄煎的水煎剂,结合其相关免疫指标和生殖内分泌指标,经统计分析,揭示与比较二至丸、地黄煎对小鼠免疫和生殖内分泌系统的调节作用及调节机制。2研究方法采用KM雌性小白鼠随机分为6组：正常对照组、模型组、香菇多糖组、二至丸合地黄煎组、二至丸组和地黄煎组。除了正常对照组外,其余各组均给小鼠ip环磷酰胺建立免疫低下模型,各组分别按设计剂量连续ig给药1周。每日观察并记录小鼠生活状态,给药结束后处死小鼠分离脏器血清,进行以下指标的观察与检测：①检测小鼠胸腺指数、脾指数、卵巢指数及子宫指数；②通过HE染色观察胸腺及卵巢的形态学改变；③通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中IL-1a水平,用放射免疫法(RIA)检测血清中雌二醇(E2)的水平；④通过免疫组化法测脾脏、胸腺中雌二醇受体(ER)表达,测卵巢、子宫白介素1受体(IL-1R)表达；⑤用流式细胞术(FCM)检测小鼠脾细胞的细胞周期及脾细胞的凋亡率。3研究结果3.1二至丸、地黄煎对小鼠一般生活状态、免疫器官及生殖内分泌器官的影响3.1.1小鼠的一般生活状态观察与正常对照组小鼠比较,其余各组小鼠均于注射环磷酰胺后第1天开始出现精神萎靡、反应迟钝、体毛稀少、体重下降等表现。但各治疗组小鼠与模型组小鼠比较,状态有所改善。3.1.2免疫器官脏器指数及形态学观察与正常对照组比较,环磷酰胺可使小鼠的胸腺指数和脾指数下降,而各用药组均对此具有升高作用,其中,对于脾指数的升高作用明显,具有统计学意义(P<0.01-0.05)；二至丸单用对于胸腺指数的升高作用较好,具有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组比较,环磷酰胺能使小鼠胸腺体积变得狭长细小,髓质明显萎缩,皮质层相对较厚,生发中心明显减少,而各用药组对其均有不同程度的改善作用。3.1.3生殖内分泌器官脏器指数及形态学观察与正常对照组比较,环磷酰胺可使小鼠的卵巢指数和子宫指数下降,而各用药组均对此具有升高作用,其中,对于子宫指数的升高作用明显,具有统计学意义(P<0.01)。二至丸、地黄煎单用或两者合用对于子宫指数的升高效果一致,三者之间差异不具有统计学意义。香菇多糖组、二至丸合地黄煎组及地黄煎组.对于卵巢指数的升高作用较好,具有统计学意义(P<0.01～0.05),其中香菇多糖组及地黄煎组效果尤为突出,二至丸单用对于卵巢指数的升高作用不明显,不具有统计学意义。与正常对照组比较,模型组小鼠卵泡形状不规则,原始卵泡减少,生长卵泡增多,各用药组对此均有不同程度的改善作用。3.2二至丸、地黄煎对小鼠血清IL-1a、卵巢和子宫IL-1R水平表达的影响3.2.1与正常对照组比较,环磷酰胺可使小鼠血清中IL-1a的含量下降,而各用药组均对此具有升高作用,其中,二至丸合地黄煎组及二至丸组对于IL-1a的升高作用明显,具有统计学意义(P<0.05)。3.2.2免疫组化显示IL-1R在卵巢中的水平明显高于在子宫中的水平。正常对照组卵巢中IL-1R分布均匀,范围广泛；模型组卵巢中IL-1R分布较乱,范围缩小；各用药组卵巢中IL-1R分布较均匀,范围较广,与模型组比较,有所改善。正常对照组子宫中IL-1R分布较少,模型组可见少量分布,各用药组可见少量分布,正常对照组、模型组及各用药组之间无明显差异。3.3二至丸、地黄煎对小鼠血清E2、胸腺和脾脏ER水平表达的影响3.3.1与正常对照组比较,环磷酰胺可使小鼠血清中E2的含量下降,而各用药组均对此具有升高作用,其中,二至丸合地黄煎组及阳性药物香菇多糖组对于E2的升高作用明显,具有统计学意义(P<0.01～0.05)。3.3.2免疫组化显示胸腺与脾脏中ER的分布差异不大。正常对照组胸腺中ER分布均匀广泛,染色呈强阳性；模型组胸腺中ER分布杂乱不均,染色呈弱阳性；用药组中香菇多糖组、二至丸合地黄煎组、二至丸组胸腺中ER的分布较均匀,范围较广,与模型组比较,有一定改善。正常对照组脾脏中ER分布均匀广泛,染色呈强阳性；模型组脾脏中ER分布不均匀,且范围较小,染色呈弱阳性；各用药组脾脏中ER的分布较均匀,范围较广,与模型组比较,有一定的改善。3.4二至丸、地黄煎对小鼠脾细胞周期及细胞凋亡的影响3.4.1脾细胞的细胞周期环磷酰胺能明显抑制脾细胞增殖,各用药组均能拮抗环磷酰胺引起的脾细胞增殖抑制,表现为G0+G1期较环磷酰胺模型组减少,S期明显增加,G2+M期减少,其中二至丸组及地黄煎组G2+M期减少较明显,具有统计学意义。二至丸、地黄煎单用与合用效果比较显示,两药合用S期增加更明显,G0+G1期减少更明显,差异具有统计学意义。3.4.2脾细胞的细胞凋亡率环磷酰胺能明显诱导小鼠脾细胞凋亡,经用药后,除了香菇多糖组外,其余各用药组均能明显拮抗环磷酰胺引起的脾细胞凋亡,具有统计学意义(P<0.01)。二至丸、地黄煎单用与合用效果比较,差异无统计学意义。4结论①二至丸、地黄煎单用或者两者合用对于免疫低下小鼠的一般生活状态、免疫器官的脏器指数(胸腺指数、脾指数)及生殖内分泌器官的脏器指数(卵巢指数、子宫指数)均有一定的改善作用,单用与合用的效果差异不大,与阳性药物香菇多糖的效果基本一致。胸腺、卵巢HE染色的结果与上述脏器指数的结果基本一致。②二至丸、地黄煎单用或者两者合用对于免疫低下小鼠血清中免疫细胞因子IL-1a的水平均有一定的改善作用,合用比单用及阳性药物香菇多糖的效果好；对于生殖内分泌器官(卵巢)中的白介素1受体(IL-1R)的含量均有不同程度的改善作用,单用与合用的效果差异不明显。③二至丸、地黄煎单用与合用对于免疫低下小鼠血清中雌激素E2的水平均有一定的改善作用,合用比单用的效果好,阳性药物香菇多糖对于E2水平的改善作用更好；对于免疫器官(胸腺、脾脏)中的雌二醇受体(ER)含量均有不同程度的改善作用,单用与合用的效果差异不明显。④二至丸、地黄煎单用与合用对于免疫低下小鼠脾细胞的细胞周期S期(DNA合成期)具有显著的提高作用,合用比单用的效果好,均比阳性药物香菇多糖的效果好。二至丸、地黄煎能明显拮抗环磷酰胺引起的脾细胞凋亡,单用与合用的效果差异不明显,均比阳性药物香菇多糖的效果好。⑤环磷酰胺作为传统免疫低下造模药,在打击免疫器官的同时,对于生殖内分泌器官的打击同样存在,也就是说它既能造成免疫低下,也能造成生殖内分泌系统的紊乱。⑥二至丸、地黄煎对于实验性免疫低下小鼠的免疫指标、生殖内分泌指标均有一定的改善作用,在提高免疫功能的同时,对其生殖内分泌系统的功能也有一定的增强作用；也就是说免疫功能的提高有助于生殖内分泌系统恢复平衡,而生殖内分泌系统的平衡对于免疫功能的恢复也具有一定的作用。二至丸、地黄煎对于免疫生殖内分泌系统具有一定的网络调节作用。⑦单用二至丸对于胸腺指数的改善效果较好；单用地黄煎对于卵巢指数的改善效果较好；对于血清中IL-1a、E2水平及脾细胞周期S期的改善方面,两者合用的效果比单用的效果好。综合考虑,对于免疫生殖内分泌系统的调节,二至丸、地黄煎两者合用比单用更具优势。5创新之处①现国内外有关二至丸的实验研究主要集中在对免疫方面的研究,对生殖内分泌系统影响机制的研究较少,关于地黄煎的研究,至今还没有发现,这也是本研究的创新之一②本研究的创新之处还在于,将生殖内分泌与免疫两大系统相结合,证实二至丸、地黄煎在增强免疫功能的同时,也能调节其生殖内分泌系统中相关激素的水平,而生殖内分泌系统的恢复对于免疫功能同样具有增强作用,最终达到免疫生殖内分泌系统相平衡的状态,并将二至丸、地黄煎单用与合用做一比较,为二至丸、地黄煎在临床上更为广泛的应用提供理论依据和实验基础。