农杆菌介导番茄和牛膝的遗传转化及霸王组培再生

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Ⅰ 本实验利用发根农杆菌A4,9402Bin19,ATCC15834三个菌株感染怀牛膝的叶切片和茎段外植体,获得毛状根转化体,并筛选了优质株系。三个菌株诱导毛状根的频率明显不同,ATCC15834的转化频率最高,为60%~80%,A4的转化频率为40%~55%,9402Bin19的转化频率最低,为30%~40%。且叶切片外植体的转化频率高于茎段外植体。 ATCC15834菌株诱导牛膝产生的毛状根可在无任何激素的MS培养基上快速生长,且具有分枝性强、丛生、无向地性等特点。通过对液体培养条件的选择,发现牛膝毛状根在MS液体培养基上(25℃、110r/min暗培养)获得最大生长速率,经25d培养,牛膝毛状根鲜重增加了8.4倍。利用高效液相色谱法测定毛状根中齐墩果酸含量发现,发根系w02中齐墩果酸含量达到25.59mg/g,超过栽培一年生牛膝根中齐墩果酸量(14.73mg/g)。用高压纸电泳方法在牛膝毛状根中检测到甘露碱的存在。PCR反应证明:本研究获得的牛膝毛状根确已被ATCC15834菌株Ri质粒的T—DNA所转化,并被整合到毛状根牛膝DNA上。 利用ATCC15834菌株诱导牛膝产生的毛状根在附加在1.5mgL-12,4-D,0.5mgL-16BA的MS培养基上,经过两周就可诱导出愈伤组织。当愈伤组织转移到附加1.0mgL-16BA,0.5mgL-1NAA的MS培养基上后分化出大量芽。所有这些芽能够进一步生长,并且在含有1.0mgL-1IBA的MS培养基上诱导生根,长成小植株。 Ⅱ 以番茄“早魁”品种为材料,通过对子叶切块和茎段培养,建立了番茄组织培养的再生体系,为番茄的遗传转化提供了良好的受体系统;通过根癌农杆菌介导,将内抑素基因导入番茄,得到了转化再生植株。对再生植株PCR以及RT-PCR检测结果均呈阳性,从而初步建立了番茄的遗传转化体系。 Ⅲ 以霸王(Zygophyllum xanthoxylon Maxim)的叶基切段为外植体进行离体培养。在附加2mgL-12,4-D,0.2mgL-16BA的MS培养基上诱导出愈伤组织。当愈伤组织转移到附加1mgL-16BA,0.5mgL-1NAA的MS培养基上培养后分化出大量的苗。分化苗在含有1mgL-1KT的MS培养基上诱导生根。细胞学观察表明,再生植株的染色体数正常,为2n=22;但RAPD分析显示,在再生苗中出现了一条约
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