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非生物逆境例如干旱、高盐、低温等严重影响着植物的生长发育以及农作物的产量。玉米作为重要的经济和粮食作物,在整个生育期需水量大,抗旱性较差。在水资源严重短缺的今天,如何借助分子育种手段改良玉米的抗旱性对于应对极端天气以及水短缺具有重要的现实意义。
本实验室前期通过酵母单杂交的方法克隆得到与玉米过氧化氢酶基因(Cat)启动子区的ABRE2(ABA Responsive Element2)元件特异结合的bZIP类转录因子ABP9基因,并证明ABP9参与植物体内ABA信号传导以及ROS的代谢平衡,过表达ABP9显著提高了转基因拟南芥的抗逆性。为进一步阐明ABP9在玉米内源系统中的生物学功能,研究室已经利用农杆菌介导和基因枪的遗传转化方法将ABP9基因导入玉米受体材料齐319中。利用分子手段对转基因植株连续多世代的检测和监控,拟通过获得稳定遗传的转ABP9基因玉米的纯合株系;并结合苗期的抗旱生理试验初步鉴定ABP9的抗旱功能,并据此进一步筛选抗旱强的转基因株系。
利用特异性的引物分别对有代表性的BC4F第8代(7个株系67植株),BC4F第9代(11个株系80植株),BC4F第10代(2个株系51植株),以及新疆(4株系40植株)和海南大田(77株系27植株)转基因植株进行PCR鉴定,并选择其中29个株系的64株阳性植株进行southern检测。结果表明,F8代的阳性率为61.19%,F9代的阳性率为32.5%,F10代的阳性率为23.53%.对F8代中阳性率为100%的U8-49和U8-50两个株系进行世代追踪,结果表明该两株系后代的阳性率分别为42%和11.1%;而对F9代中阳性率分别为28.6%和50%的U8-(82)2-78B和U8-(82)8-84C进行追踪,结果表明两株系后代的阳性率分别为16.7%和33.3%。综上结果表明无论是群体间还是株系间,随繁殖代数增加,获得阳性植株的机率减少;即使是阳性率为100%的后代也会发生分离,且分离不符合孟德尔遗传规律。推测可能与玉米基因组的跳跃性相关,但具体的分离机制有待进一步研究。新疆材料后代U8-(82)2-78B-1和U8-(82)8-84C-3Southem检测为阳性,但是后代鉴定结果为阴性。
本论文得到的主要结论有:
1.通过常规PCR的方法和测序比对,分别对基因枪和农杆菌介导的遗传转化方法获得的转ABP9玉米材料进行多世代连续跟踪检测,鉴定出纯合的三个过表达株系U8-49和U8-50以及U8-51,以及若干纯合度较高的株系;但其后代仍分离。
2.对2011年廊坊和海南PABP9-ABP9植株PCR鉴定,发现若干纯合度较高的株系。但未获得纯合转基因株系;
3.Southern杂交结果显示两个过表达系有特异条带,分别是新疆材料的后代株系U8-(082)2-78B-1;U8-(082)8-84C-3;
4.转ABP9玉米植株的幼苗具有抗旱表型,经旱处理后复水,四个过表达系植株的存活率明显高于野生型植株。
综上,在玉米内源系统中过表达ABP9可进一步提高玉米的抗旱能力。