论文部分内容阅读
研究背景Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)及维甲酸诱导基因Ⅰ样受体(RIG-1-like receptors,RLRs)等识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)后,可通过募集多种不同接头分子,激活TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)。活化的TBK1磷酸化干扰素调节因子3(interferon regulatory 3,IRF3),促进其二聚化及核内转位,进而形成有活性的转录复合体,启动Ⅰ型干扰素(IFNα/β)基因转录。Ⅰ型干扰素可与Ⅰ型干扰素受体结合,通过JAK-STAT通路,诱导多种抗病毒基因的表达。因此,TBK1作为Ⅰ型干扰素产生所必需的关键激酶,其适度活化对机体抗病毒免疫及维持免疫稳态均非常重要。已有报道,多个E3泛素连接酶可通过促进TBK1泛素化,调控TBK1表达及活化;然而去泛素化酶及其介导的去泛素化,对TBK1表达及活化的影响尚不清楚。泛素特异性蛋白酶1(ubiquitin specific peptidase,USP1)是泛素特异性蛋白酶家族中的一员,能够去除一系列底物的泛素化修饰,进而参与调控多种信号通路。USP1 可与 USP1 相关因子 1(USP1-associatedfactor1,UAF1)结合形成一个去泛素化酶复合体,并显著增强USP1的去泛素化酶活性。USP1-UAF1去泛素化酶复合体通过去除其靶分子的泛素化修饰,参与多个信号通路的调控,如调节DNA损伤修复过程和肿瘤发生过程等。然而,USP1-UAF1去泛素化酶复合体在免疫系统,特别是固有抗病毒免疫反应中的作用,尚不清楚。本研究中,我们发现病毒感染可诱导USP1和UAF1的表达;USP1-UAF1去泛素化酶复合体可抑制TLR3/4和RIG-I介导的IRF3活化以及后续的IFN-β的分泌。USP1、UAF1均可特异性结合TBK1,并去除其K48位偶联的泛素化修饰,进而稳定TBK1的蛋白表达。同时,USP1-UAF1去泛素化酶复合体的特异性抑制剂ML323,可抑制TBK1蛋白表达及IFN-β分泌。小鼠病毒感染模型中,ML323处理抑制抗病毒固有免疫反应,并促进病毒复制。本研究为TBK1活化提出了新的调控机制;USP1-UAF1去泛素化酶复合体可能作为潜在靶点,用于病毒感染性疾病等的防治。材料和方法1.USP1-UAF1对IFN-β表达的影响1.1.USP1-UAF1特异性抑制剂ML323不同浓度(0,15,30,60 μM.)预处理小鼠原代腹腔巨噬细胞4h后,仙台病毒(Sendai virus,SeV)感染12h,ELISA检测IFN-β的分泌情况。1.2.设计合成分别针对USP1、UAF1的特异性干扰RNA(siRNA),使用脂质体Interferin将siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞,36h后,分别用LPS、poly(I:C)刺激或SeV感染细胞,ELISA检测IFN-β、TNF-α及IL-6的分泌情况。1.3.构建USP1、UAF1表达质粒,使用脂质体JetPEI将USP1、UAF1表达质粒及相关报告基因质粒,共转染入RAW264.7细胞;24h后,分别用LPS、poly(I:C)刺激或SeV感染细胞,报告基因检测IFN-β及NF-κB报告基因活化情况。1.4.分别用SeV感染或IFN-β刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞不同时间,Western blot检测USP1和UAF1的表达变化。2.USP1-UAF1对IRF3活化的影响2.1.利用脂质体JetPEI将分别USP1、UAF1表达质粒及不同接头分子,与IRF3或NF-κB报告基因质粒,共转染入HEK293T细胞。报告基因检测由TRIF、TBK1介导的IRF3报告基因活化情况,以及由Myd88、TRIF、RIG-I介导的NF-κB报告基因活化情况。2.2.利用脂质体Interferin分别将USP1、UAF1 siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞;36h后,分别用LPS刺激或SeV感染细胞;Western blot检测IRF3及STAT1的磷酸化变化。3.USP1-UAF1与TBK1的相互作用3.1.利用脂质体JetPEI将USP1、UAF1表达质粒及不同接头分子,与IFN-β报告基因质粒,共转染入HEK293T细胞;报告基因检测由RIG-I、MDA5、MAVS、TRIF、TBK1、IRF3-5D介导的IFN-β报告基因活化情况。将USP1、UAF1表达质粒及TBK1,分别与IRF3、ISRE或NF-κB报告基因质粒,共转染入HEK293T细胞;报告基因检测由TBK1介导的IRF3、ISRE、NF-κB报告基因活化情况。3.2.LPS刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞不同时间点,Western Blot检测USP1、UAF1的表达情况及USP1细胞内定位变化。3.3.利用脂质体Lipofectamine2000将USP1或UAF1表达质粒同多个接头分子表达质粒共转染入HEK293T细胞中,培养24h后,利用免疫共沉淀结合Western Blot检测USP1、UAF1与TLR/RLR信号通路中的不同分子的结合情况。3.4.LPS刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞不同时间点,利用免疫共沉淀结合Western Blot检测USP1、UAF1与TBK1、IRF3等分子的内源性结合情况。4.USP1-UAF1对TBK1泛素化及蛋白表达的影响4.1.利用脂质体Lipofectamine2000将TBK1、Ub或K48-Ub表达质粒,分别与USP1野生型质粒、USP1去泛素化酶功能缺失突变体USP1-C90S或UAF1表达质粒,共转染入HEK293T细胞,培养24h后,利用免疫共沉淀结合Western Blot检测USP1、USP1C90S、UAF1对TBK1泛素化的影响。4.2.利用脂质体Lipofectamine2000分别将不同剂量的USP1、UAF1表达质粒转染入HEK293T细胞中,培养24h后,Western Blot检测不同剂量USP1、UAF1对TBK1及IRF3蛋白表达的影响。4.3.USP1-UAF1特异性抑制剂ML323预处理小鼠原代腹腔巨噬细胞4h后,LPS刺激不同时间点,Western Blot检测TBK1的表达情况。4.4.利用脂质体Interferin分别将USP1、UAF1 siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞;36h后,分别用LPS刺激或SeV感染细胞,Western Blot检测TBK1表达情况。4.5.ML323预处理小鼠腹腔原代巨噬细胞,LPS刺激4小时后,蛋白合成酶抑制剂CHX作用不同时间点,Western Blot检测TBK1的表达情况。5.USP1-UAF1复合体在体内和体外情况下对病毒诱导的IFN-β产生的调控5.1.ML323处理小鼠腹腔原代巨噬细胞,ELISA检测病毒诱导产生的IFN-β;RT-PCR检测IFN-β和下游响应基因mRNA水平,以及细胞内病毒的复制情况。5.2.C57BL/6(雄性,8周)小鼠腹腔注射淀粉诱导腹腔原代巨噬细胞。三天后利用DMSO或ML323处理,随后VSV病毒感染小鼠12小时。ELISA检测小鼠腹腔渗出液中IFN-β的含量;5.3.C57BL/6(雄性,8周)小鼠腹腔注射ML323(10mg/kg),4小时后再腹腔注射水胞性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)。8小时取外周血,ELISA检测血清中IFN-β的含量;RT-PCR检测肝、肺、脾组织中IFN-β的mRNA水平和VSV病毒复制情况。5.4.C57BL/6(雄性,8周)小鼠腹腔注射DMSO或ML323(10mg/kg)预处理,接着腹腔注射水胞性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)。18小时取肺组织进行石蜡包埋切片进行H&E染色。研究结果1.USP1-UAF1 增强 IFN-β的表达ML323可以显著降低由SeV介导的小鼠腹腔巨噬细胞IFN-β的分泌,且呈现明显的剂量依赖性;利用USP1、UAF1 siRNA处理明显降低小鼠原代腹腔巨噬细胞中LPS、poly(I:C)、SeV诱导的IFN-β分泌。USP1、UAF1过表达可显著提高RAW267.4细胞中LPS、poly(I;C)、SeV介导的IFN-β报告基因活性,但对NF-1κB报告基因活性没有明显影响。2.USP1-UAF1增强IRF3的活化USP1、UAF1高表达均可显著增强由TRIF、TBK1介导的IRF3报告基因活性,但是对于MyD88、TRIF、RIG-I介导的NF-κB报告基因活性没有明显影响;USP1、UAF1基因沉默显著降低小鼠原代腹腔巨噬细胞中LPS、SeV介导的IRF3及STAT1的磷酸化。3.USP1-UAF1 与 TBK1 结合TBK1与USP1或UAF1表达质粒共转入HEK293T,免疫共沉淀发现TBK1与USP1、UAF1均可结合。小鼠腹腔原代巨噬细胞中,TBK1可与USP1和UAF1内源性结合;TBK1与USP12和USP46均不结合。4.USP1-UAF1去除TBK1的K48位偶联泛素化,稳定其表达USP1、UAF1均可显著降低TBK1泛素化及K48位偶联的泛素化修饰;USP1、UAF1高表达可以显著增加HEK293T细胞中TBK1的蛋白表达,且呈现剂量依赖现象;USP1、UAF1基因沉默后,小鼠原代腹腔巨噬细胞中TBK1蛋白表达明显下降;加入CHX后ML323处理组细胞内的TBK1含量明显低于对照组。5.ML323增强固有抗病毒免疫反应ML323处理显著降低小鼠原代腹腔巨噬细胞中VSV介导的IFN-β、ISG15的表达,促进VSV病毒复制;ML323处理可明显降低VSV诱导的小鼠腹腔渗出液以及外周血中IFN-β的含量,同时小鼠肝、肺、脾组织内IFN-βmRNA也明显下降,相对的病毒复制量明显提高。肺组织石蜡切片H&E染色结果也显示ML323处理组炎性细胞渗出情况较对照组更为明显。结论1.USP1-UAF1去泛素化酶复合体特异性结合TBK1,去除TBK1 K48位偶联的泛素化修饰,抑制TBK1降解,进而促进TLR及RIG-I介导的Ⅰ型干扰素表达。2.USP1-UAF1去泛素化酶特异性抑制剂ML323在小鼠病毒感染模型中,抑制机体抗病毒固有免疫反应,并促进病毒复制。创新性及研究意义1.发现了特异性去除TBK1 K48偶联的泛素化修饰的去泛素化酶USP1;揭示新的TBK1活化调控机制,丰富了对抗病毒固有免疫反应调控的认识。2.发现USP1-UAF1去泛素化酶特异性抑制剂ML323,抑制Ⅰ型干扰素表达及机体抗病毒免疫反应。3.为USP1-UAF1去泛素化酶复合体作为一个潜在的抗病毒药物靶点提供了理论依据。