论文部分内容阅读
棉花(Gossypium hirsutum)作为一种可分解和可持续资源，在现代纺织工业中发挥重要作用，与人类生活息息相关。棉花纤维是一种单细胞结构，是细胞伸长和细胞壁合成研究的良好模型。随着众多科研的开展，棉花纤维发育的分子机制已成为研究的热点之一，为提高棉花纤维的产量和品质揭开了新篇章。
超长链脂肪酸(very—long chain fatty acids，VLCFAs)，是指生物体内碳原子数超过18个碳原子的脂肪酸。植物VLCFAs是种子甘油酯、表面蜡质、生物膜磷脂及鞘脂的重要组成成分。VLCFAs在细胞内担当重要功能，包括蛋白运输、构建和稳定细胞膜、作为脂类第二信使的前体等。研究表明，VLCFAs对纤维伸长起到明显的促进作用。VLCFAs的合成是通过不断将来自丙二酰—CoA的C2部分加到质体脂肪酸从头合成途径产生的C18酰基头部而延伸。VLCFA合成酶复合体位于内质网膜，包括3—酮脂酰—CoA合酶(KCS)、3—酮脂酰—CoA还原酶(KCR)、3—羟脂酰—CoA脱水酶(HCD)、反式—2—烯脂酰—CoA还原酶(ECR)四步酶。
本文成功克隆两个棉花ECR。ECR是一类依赖于NADPH的还原酶，催化超长链脂肪酸延伸的第四步反应。qRT—PCR表明ECR1&2在纤维的快速伸长期都被高调，并且，ECR2在快速伸长纤维细胞中显著高表达。利用酵母ECR基因突变体致死表型，对两个棉花ECR基因进行了功能互补实验，发现ECR1&2均能够很好地互补突变体酵母，使之基本恢复到野生型生长状态，证明ECR1&2均编码有功能的反式—2—烯脂酰—CoA还原酶。酵母亚细胞定位实验的结果表明，ECR1＆2定位于酵母的内质网膜上。利用多序列比对和定点突变技术，筛选出G225、1231、P232和G234四个氨基酸位点影响ECR活性，即其中任何一个氨基酸的突变都使ECR2互补的突变体酵母不能成活。Western—blot显示这些突变蛋白在酵母体内都能够正常表达，表明突变点没有对蛋白的稳定性造成影响。利用GC—MS技术对突变ECR2互补酵母的脂肪酸组成进行分析，发现相对于野生型ECR2互补酵母，突变组酵母C26：0含量显著下降，同时积累了大量羟基化的C16：0和C18：0，说明这四个氨基酸位点对ECR2蛋白的功能有重要影响。在蛋白质数据库中，搜索和比对已知的NAD/NADP结合蛋白，鉴定了植物ECR蛋白可能结合NADPH的G(5X)IPXG模体。另外，通过定点突变和酵母互补分析，鉴定了Y100、K144、R145三个位点，对ECR酶活性至关重要。
本文还克隆了一个棉花KCR(KCR3)。qRT—PCR表明KCR3在纤维的快速伸长期有明显高调。利用酵母KCR基因突变体ybr159W△生长缓慢表型，将克隆的KCR3互补突变体酵母，发现KCR3能够使突变体酵母基本恢复到野生型酵母生长状态。GC—MS分析发现，突变体酵母中C26：0含量明显降低，同时累积了大量的C22：0和羟基化的C22：0，而用KCR3互补的突变体酵母中，C26：0含量明显回复。以棕榈酰—CoA、丙二酰—CoA为底物，用KCR3互补突变体酵母的微粒体进行体外超长链脂肪酸的延伸反应，实验结果证明KCR3编码有功能的3—酮脂酰—CoA还原酶，并且是NADPH依赖的。用E.coli成功表达出可溶的KCR3—MBP融合蛋白，以C3、C6、C7—13不同碳链长度的直链醛为底物，表现出依次升高的还原酶活性。酵母亚细胞定位实验显示，KCR3既存在于膜中，又存在于细胞质中。因此，推测KCR3可能是一个多功能酶，在细胞的不同部位发挥着不同的功能。
综合上述，棉花ECR和KCR基因的克隆与功能研究对解析VLCFA的合成机制及VLCFA对棉花纤维伸长的调控机制奠定了理论基础。