论文部分内容阅读
肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E. coli, EHEC)感染是一种重要的人畜共患病,在世界各地包括发达及发展中国家都有流行,其感染具有暴发性、强烈的致病性与致死性等特点,已成为全球性的公共卫生问题,对人类健康构成巨大威胁。EHEC感染可使人患腹泻(Diarrhea)、出血性结肠炎(Hemorrhagic Colitis, HC),还可引发溶血性尿毒综合征(Hemolytic Uremic Syndrome, HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(Thromboric Thromobocytopenic Porpura, TTP)等严重并发症,特别是HUS可对患者肾脏造成不可恢复性的功能损伤,病死率较高。EHEC所分泌的志贺毒素(Shiga toxin, Stx)是介导细菌致病的重要因子,Stx可以穿越破损的肠上皮细胞进入血液循环,与其受体-丙糖酰基鞘氨醇(globotriaosylceramide, Gb3)或丁糖酰基鞘氨醇(globotetraosylceramide, Gb4)结合,造成肠道、中枢神经系统等器官的损伤,特别是Gb3受体含量较高的肾脏,受损后易引发HUS,危及生命。因此,Stx已经成为诊断、治疗EHEC感染及其并发症的靶向分子,本研究旨在制备StxⅠ型A亚单位(Stx1 A)勺单克隆抗体。根据GenBank公布的Stx1A基因序列设计引物,以EHEC O157:H7分离株基因组DNA为模板,PCR扩增出具有完整开放阅读框架(Open Reading Frames, ORF) Stx1A基因,序列分析表明扩增的Stxl A基因核苷酸序列与GenBank公布序列一致。将Stx1A基因经过限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到pET-22b(+)中,构建原核表达载体pET-22b(+)-Stx1A,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG低温诱导表达重组蛋白Stx1A,重组蛋白Stx1A经细胞破碎仪破碎后,用NiSO4亲和层析柱纯化、PBS透析获得纯化的重组蛋白Stx1A。SDS-PAGE与蛋白质免疫印迹法(Western blotting)结果表明重组蛋白与其预期大小相符,质谱分析结果表明该重组蛋白即为Stx I型A亚单位。重组Stx1A蛋白与弗氏佐剂充分乳化,免疫BALB/c小鼠,经酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测、多次有限稀释亚克隆、筛选得到能稳定分泌抗Stx1A单克隆抗体的杂交瘤细胞株6株,分别命名为5D3-H6、10G9-D9、4E2-H4、6E10-D11、8E7-E6、2F6-F8。结果表明其中两株单抗,8E7-E6和2F6-F8能与天然Stx1毒素实现有效的杂交。该两株杂交瘤细胞在体外连续传代3个月和冻存后再复苏均不影响抗体分泌的稳定性。总之,Stx1A特异性单抗的制备为肠出血性大肠杆菌的快速、特异性诊断奠定了基础。