竹节参的分子鉴定及其β-香树脂醇合成酶基因克隆、生物信息学分析

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目的:  竹节参为五加科人参属植物,其主要活性成分为三萜皂苷化合物。分布地域广泛,变异性较大。为了深入研究竹节参的生物活性及其药材的真伪,本项目利用GenBank核酸数据库中ITS2序列对竹节参进行系统进化鉴定,并克隆三萜皂苷代谢关键酶竹节参β-香树脂醇合成酶(beta-amyrin synthase,β-AS)基因cDNA序列全长,同时采用生物信息学分析β-AS蛋白序列及其结构与功能,为竹节参皂苷合成及调控机制研究提供基础。  方法:  (1)提取竹节参样本基因组DNA,使用ITS2通用引物扩增ITS2序列并测序,测序结果使用CodonCode Aligner V5.1进行校对拼接,与GenBank核酸数据库进行BLAST比对,应用MEGA5.0软件基于K2P模型计算遗传距离和构建系统进化树。  (2)以竹节参叶片为材料提取RNA,RT-PCR方法扩增β-AS基因编码区序列,将序列连接至pMDTM18-T载体进行克隆、测序。利用生物信息学分析比较移栽品和栽培品竹节参β-AS蛋白的特征,并使用MEGA5.0构建竹节参β-AS蛋白的系统进化树。  结果:  (1)扩增得到竹节参样本的ITS2片段长度均为230bp,并且序列一致率为100%。序列同源性分析发现,竹节参样本ITS2序列与竹节参(KT380920.1)亲缘关系最近,它们之间的K2P遗传距离为0,在NJ树上也是聚为同一枝上,支持率为75%。  (2)克隆出移栽品和栽培品竹节参的β-AS基因编码区序列,ORF均为2286bp,编码761个氨基酸。  (3)生物信息学分析发现2个品种β-AS蛋白两者在细胞中的基本结构和功能是一致的,均为亲水性蛋白,不存在信号肽,不具有跨膜结构,蛋白二级结构最主要结构元件是α-螺旋和无规则卷曲,可能定位于叶绿体,属于氧化鲨烯环化酶(OSC)家族,具有MWCRCY、QW(QXXXXXW)和DCTAE3个OSC基因家族特征保守模体。但两者之间存在8个氨基酸差异,使两者的理化性质、蛋白质二级、三级结构以及磷酸化位点稍有差异,可能会导致两者的催化活性存在差异。β-AS蛋白同源性分析结果显示,2个品种竹节参β-AS蛋白与五加科人参属植物亲缘关系最近,其中与西洋参(AGG09939.1)的同源性最高。  结论:  本研究中采用ITS2序列条形码对采集的竹节参样本进行物种鉴定,从分子水平上进一步佐证植物样本物种为五加科人参属竹节参。克隆得到野生移栽品和栽培品竹节参的β-AS基因全长,并对2个品种β-AS蛋白进行了详细的生物信息学分析和比较,为今后深入研究该酶的结构特征、功能以及其与皂苷含量的相关性提供参考,也为竹节参合成生物学研究提供了生物基因元件。
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