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原发性肝细胞肝癌是一种常见的恶性肿瘤，适合手术治疗的患者只占一少部分，具有较高的复发率，预后很差，严重威胁着人类的健康。人类肿瘤抗原以及肿瘤抗原基因的发现和确认，为肿瘤的免疫治疗尤其是主动性免疫治疗提供了新的手段。直接作用于肿瘤特异性抗原或相关抗原的预防性瘤苗是目前研究的热点。AFP通常在胎肝、胃肠道、卵黄囊中高表达，出生后表达量下降。但部分肝癌患者AFP表达异常增高，临床可作为肝癌的一个诊断指标。因此，制备AFP特异性瘤苗，诱导针对AFP的特异性免疫反应，可作为肝癌治疗的一种新思路。动物学试验已经证实，AFP-DNA疫苗不仅能够抑制肝癌细胞的生长，而且对肝细胞的再生没有影响。树突状细胞(DC)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞，它能够高效地摄取、处理抗 第四军医大学硕士学位论义一原，并将处理后的多肽呈递给静息型T细胞，引起针对该抗原的特异性兔疫反应。DC应用于肿瘤免疫治疗是目前的研究热点，许多研究证实，肿瘤患者树突状细胞的质量及功能均减弱，MHC分子和共刺激分子CD80、CD86的表达量下降，因此，体外诱导功能正常的树突状细胞，经肿瘤相关性抗原或特异性抗原修饰，作为疫苗兔疫肿瘤患者，是肿瘤治疗的一个发展方向。制备DC瘤苗的方法有肿瘤特异性抗原、肿瘤相关性抗原、肿瘤细胞裂解物与DC共培养，肿瘤细胞与DC融合、肿瘤特异性或相关性抗原基因转染DC、肿瘤细胞总mRNA转染DC等，基因转染制备DC瘤苗是目前常用的方法。目的：本研究拟构建AFP－CDNA真核表达载体，体外转染DC，制备AFP－DC瘤苗，诱导针对表达AFP的肝癌细胞株HenGZ的特异性兔疫反应，寻找新的治疗肝癌的途径；并初步探讨肝癌相关性抗原AFP作为肝癌靶向治疗的可行－性＊方法：扩增原核表达载体PRESTA－AFP，Bdl、EC袱 限制性内切酶切下AFP全长cDNA，经T4 DNA连接酶亚克隆入真核载体pCEPL的多克隆位点，经酶切、电泳鉴定，确定AFP全长cDNA准确插入真核载体pCEFL，命名为 PCEFL个FP。取健康供者外周血单个核细胞40 ml，Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，贴壁法进一步纯化细胞，收集非贴壁细胞（淋巴细胞），冻存。贴壁细胞在细胞因子 rhGM－CSP（1000 u／ml）、rhIL－4（10 ng／ml）作用下，体外诱导 DC。收集培养 5 d的 DC，PCEFL吨FP／脂质体复合物转染， 一4 一 第凹军医大学硕土学位论文一另设转染空载体组（PCEFL－DC）及空白对照组。倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜观察细胞形态，流式细胞术检测表型，细胞兔疫荧光技术、电化学发光技术检测AFP抗原分子的表达。收集各组DC，与复苏冻存的淋巴细胞按20：1比例混合接种于 24孔板，培养 5 d，收集的细胞作为效应细胞。选择表达AFP的肝癌细胞株HepGZ细胞作为靶细胞，按效靶比20：l混合接种培养24 h，同时设单一靶细胞组、单一效应细胞组。以MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。所有数据采用 SPSS．0统计学软件进行分析。结果：构建的AFP真核表达载体经酶切电泳鉴定，APP－CDNA准确地插入到真核质粒表达载体PCEFL中。诱导的DC光镜和扫描电镜下细胞周围可见毛刺状突起和树枝状突起，透射电镜下细胞表面不规则，可见各级突起，胞内可见溶酶体、线粒体，粗面内质网发达；DC特征性表型 CD、＿CDllC表达量分别为47．7％、78．49％，MHC分子HLA－DR和共刺激分子CD80、CD86表达量分别为66．09％、51．37％、55．83％，AFP－DC能够分泌AFP抗原，培养上清中AFP含量为0．8805 IU砌1，与空载体组和空白对照组相比，差异显著（Pofo 05；免疫荧光检测可见 AFPoC胞浆及胞膜均有 AFHv抗原分子表达；其活化的CTL对表达APP的肝癌细胞株HPPGZ杀伤率可达 84．05％，与空载体组和空白对照组比较，差异显著（P40 05）。结论：本研究应用 GM六SF、IL叶作用于外周血外周血单个核细胞，成功的诱导出DC；AFP基因经脂质体转染未成熟DC，转染后的DC可表达APP，并能够诱导出对AFP特异性CTL，CTL对表达AFP的肝癌细胞株HeeGZ 一5 一 第四军医大学硕士学位论文强的杀伤作用。本研究证实，AFP－DC疫苗可以作为表达AFP肝癌的一种免疫治疗手段，为将来DC瘤苗的临床应用奠定了基础。目前，肿瘤抗原特别是纯化的肿瘤抗原获取比较困难，我们应用AFP全长切NA转染取代肿瘤抗原致敏DC，可以很好地解决这一问题。我国是肝癌高发大国，许多肝癌患者AFP表达异常升高，本研究应用APP1DNA转染DC制备的DC疫苗对表达AFP的肝癌细胞株HepGZ有强的杀伤作用，因此，AFP作为靶点治疗肝癌具有可行性，AFP可作为肝癌靶向治疗的新的突破点。