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研究背景与目的有临床研究发现使用高剂量促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）会增加慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）患者心血管事件发生率。而血管钙化也是CKD患者发生心血管事件的重要危险因素。虽然还没有临床研究表明EPO与血管钙化有直接关系,但有体外实验证明,EPO在高剂量下能够导致血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）钙化,但其机制不清。此外,CKD患者长期处于微炎症状态,而炎症也是血管钙化的危险因素。那么在EPO诱导的血管钙化中,炎症是否能够发挥叠加或者协同效应目前也不清楚。因此,本研究的目的是探讨EPO导致血管钙化的分子调控机制以及炎症状态下EPO对血管钙化的影响。实验方法1.体外实验（1）从Sprague-Dawley（SD）大鼠胸主动脉提取原代血管平滑肌细胞,用组织块贴壁法培养。（2）用不同浓度EPO（0 U/m L,50 U/m L,150 U/m L,250 U/m L）刺激原代血管平滑肌细胞（VSMCs）。通过茜素红染色,钙盐定量,碱性磷酸酶（ALP）活性测定血管平滑肌细胞钙化水平。用DCFH-DA探针检测细胞活性氧水平。（3）选择EPO诱导钙化最佳浓度刺激VSMCs。加入活性氧清除剂NAC观察细胞钙盐沉积。通过转录组测序对EPO刺激下产生的差异表达基因进行筛选,用PCR,Western Blot验证差异基因并检测VSMCs标志蛋白SM22α和α-SMA。用DNA下拉（Pull down）,染色质免疫沉淀（Ch IP）和双荧光素酶实验证实目的基因与钙化相关蛋白的相互作用关系。用慢病毒分别敲低和过表达目标基因以验证其促钙化效应,接着在EPO刺激下敲低目标基因进行回复实验。（4）用EPO和TNF-α刺激VSMCs。通过茜素红染色,钙盐定量,碱性磷酸酶（ALP）活性测定细胞钙化水平。用DCFH-DA探针检测细胞活性氧水平。用PCR,Western Blot检测成骨相关蛋白表达以及抗钙化蛋白MGP的表达。分别用EPO,TNF-α或二者同时刺激细胞0,5,10,60分钟,用Western Blot检测pp38与p38蛋白水平。加入p38抑制剂SB203580后观察细胞的钙化情况,活性氧水平和钙化相关蛋白表达。2.体内实验将30只SD大鼠随机分为6组（每组5只）:对照组（n=5）,低剂量EPO（1000 U/kg/W）组（n=5）,中剂量EPO（1500 U/kg/W）组（n=5）,高剂量EPO（2000 U/kg/W）组（n=5）,酪蛋白组（n=5）和酪蛋白+高剂量EPO组（n=5）。EPO经腹腔注射,每周三次连续20周。10%酪蛋白隔日经皮下注射（1.2 g/kg）连续20周以建立全身慢性炎症模型。所有大鼠喂以高磷饮食（1.2%磷）。取血液标本检测炎症因子（IL-6,TNF-α,IL-1β,IL-10）水平。取腹主动脉用茜素红染色检测钙化水平;用Western Blot,免疫荧光染色检测组织中成骨相关蛋白表达水平;用PCR检测组织中成骨相关蛋白m RNA表达水平。结果1.体外实验结果（1）EPO以浓度依赖的方式显著上调VSMCs钙盐沉积,ALP活性和活性氧水平。（2）与EPO组相比,EPO+NAC组细胞钙盐沉积明显减少。转录组测序结果显示与对照组相比,EPO组有88个上调基因和59个下调基因,其中与骨形成相关的基因表达显著增加,即GATA6,BMP2,RUNX2,OPN和OCN。PCR,Western Blot与免疫荧光结果显示EPO确实能上调GATA6,BMP2,RUNX2,OPN和OCN的表达并且下调SM22α和α-SMA的表达。（3）Pull down,Ch IP与双荧光素酶实验证实GATA6可以与BMP2启动子区结合并促进BMP2的转录。与对照组相比,过表达GATA6能显著升高细胞的活性氧,钙盐沉积与ALP活性;而敲低GATA6后以上指标都显著下降。与EPO组相比,在EPO刺激下敲低GATA6会显著下调细胞活性氧,钙盐沉积与ALP活性。（4）与对照组相比,EPO组和TNF-α组中钙盐沉积,活性氧和GATA6,BMP2的表达显著上升,MGP显著下降;与EPO组相比,TNF-α+EPO组中钙盐沉积,活性氧和GATA6,BMP2的表达显著上升,MGP显著下降。（5）pp38/p38比值在不同时间点TNF-α和EPO+TNF-α刺激下显著上升,而在不同时间点EPO刺激下改变无统计意义。在TNF-α刺激下,不论有无EPO干预,加入p38抑制剂SB203580后与不加抑制剂组相比细胞的钙化,活性氧水平和GATA6,BMP2表达显著下降,抗钙化蛋白MGP显著升高。2.体内实验结果（1）EPO以剂量依赖的方式上调大鼠腹主动脉组织GATA6,BMP2,RUNX2,OPN和OCN的表达。高剂量EPO导致腹主动脉少量钙盐沉积。（2）与对照组相比,酪蛋白组和酪蛋白+EPO组大鼠血清IL-6,TNF-α和IL-1β显著升高,IL-10显著降低。（3）与对照组相比,酪蛋白组,EPO组和EPO+酪蛋白组钙盐沉积,GATA6和BMP2的表达显著增加;而EPO+酪蛋白组MGP表达显著下降。与EPO组相比,EPO+酪蛋白组钙盐沉积与GATA6和BMP2的表达显著增加。结论1.EPO能通过导致VSMCs表型转变,上调转录因子GATA6促进BMP2转录,上调细胞ROS水平和ALP活性而导致VSMCs钙化。2.TNF-α通过激活p38与ROS水平加重EPO诱导的VSMCs钙化。3.高剂量EPO可以导致大鼠腹主动脉钙盐沉积。炎症状态会加重EPO诱导的血管钙化。