基于环糊精聚合物和核酸探针的生物分子检测研究

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聚合物是由一种或几种重复单体以共价键连接而成的大分子化合物,在生产生活中常见的蛋白质、核酸、淀粉、纤维、塑料和橡胶等都属于这个范畴。聚合物不仅能够保持单体的性质,而且由于聚合后单体彼此间的协同作用,表现出某些独特的性能,作为基础材料在分析检测领域得到广泛应用:有些聚合物通过氢键作用、亲疏水作用、范德华力等分子间相互作用,实现特定目标物的选择性识别;有些聚合物具有信号转换和放大功能,可以将分子识别事件转化为便于检测的光、电、磁等信号;还有些聚合物可以作为骨架连接多个识别单元,通过多价作用提高识别靶标的能力,或者是连接不同的功能单元,构建多功能的分子器件。本论文选择生物相容性好、便于修饰、性能稳定的环糊精聚合物和核酸作为信号转换单元和识别单元,发展了用于酶和DNA检测的荧光分析新方法,包括以下五个方面的工作:1.利用环氧氯丙烷交联的b-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用,结合核酸外切酶反应,发展了一种新的信号放大策略用于T4多聚核苷酸激酶的检测。当T4多聚核苷酸激酶存在时,标有单芘的双链DNA探针的5′端被磷酸化,然后被Lambda核酸外切酶切割成单核苷酸,标记在单核苷酸上的芘很容易进入到β-环糊精聚合物的空腔形成主-客体包络物,产生很强的荧光,从而实现T4多聚核苷酸激酶的灵敏检测。结果表明T4多聚核苷酸激酶的检出限为0.02U/mL。这一检测方法无需荧光能量转移中所必须的淬灭基团,不需要对DNA探针进行复杂的设计。利用该方法实现了细胞裂解液中T4多聚核苷酸激酶的检测。考察了ADP、Na2HPO4和(NH42SO4对T4多聚核苷酸激酶的抑制情况,与文献报道相符,说明本方法可以用于抑制剂的筛选。2.基于空间位阻调控的b-环糊精聚合物与芘的超分子自组装,结合Lambda核酸外切酶水解作用,构建了一种简便灵敏的荧光方法用于碱性磷酸酶的检测。标记有单芘并且5′端磷酸化的双链DNA探针被Lambda核酸外切酶水解,产生的标记在单核苷酸上的芘很容易嵌入到β-环糊精聚合物的空腔,使得荧光信号显著增强。碱性磷酸酶存在时,双链DNA探针去磷酸化,限制了Lambda核酸外切酶的水解,由于双链DNA空间位阻的影响,芘很难进入β-环糊精聚合物的空腔,荧光很弱。这一检测方法无需淬灭基团的参与,设计新颖,检出限为0.04U/mL,可以实现10%人血清中碱性磷酸酶的检测。考察了Na3VO4对碱性磷酸酶的抑制情况,与文献报道相符,说明本方法可以用于抑制剂的筛选。3.基于b-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用并结合核酸工具酶,建立了一种甲基转移酶的荧光检测方法,当有甲基转移酶存在时,末端标记了芘的发夹型DNA底物上的甲基转移酶识别位点被甲基化,同时被限制性内切酶DpnI识别切割,酶切产物为短的单链DNA,标记在短链DNA上的芘很容易嵌入到β-环糊精聚合物的空腔使得荧光信号显著增强,检出限为1U/mL。我们进一步引入核酸外切酶III进行信号放大,核酸外切酶III循环水解产生大量标记在单核苷酸上的芘,它很容易与环糊精聚合物作用,荧光显著增强,使检出限降低至0.08U/mL。此外,该方法实现了10%人血清中甲基转移酶的检测。考察了硫酸庆大霉素和青霉素对Dam甲基转移酶的抑制情况,与文献报道相符,说明本方法可以用于抑制剂的筛选。4.基于阳离子型b-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用和杂交链式放大技术,发展了一种简便、灵敏的DNA检测新方法。阳离子型b-环糊精聚合物在近中性pH水溶液中带正电荷,可以通过静电作用与发夹探针H2结合,有利于标记在其末端的芘进入环糊精的空腔,发出强烈的荧光。当目标DNA存在时,目标DNA与发夹探针H1/H2杂交引发杂交链式放大技术反应,形成长的双链结构。芘嵌入长的双链中,空间位阻的影响增大,同时双链的电负性减小,芘很难进入到环糊精的空腔,荧光很弱。这一检测方法无需对探针进行双标记,相比于电中性β-环糊精聚合物,阳离子型β-环糊精聚合物对DNA探针中芘的荧光信号放大效果更加显著,实现了对目标DNA的灵敏检测,检出限达到0.1nM。并且由于阳离子型环糊精聚合物与发夹探针强的静电作用力,本方法具有良好的选择性。5.基于杂交链式放大技术和荧光铜纳米颗粒(CuNP)优良的荧光性质,发展了一种免标记和无酶的DNA检测新方法。当有目标DNA存在时,目标DNA首先与微珠上的捕获DNA杂交,其突出的粘性末端触发杂交链式反应,在微珠上形成长的双链。加入抗坏血酸和Cu2+后,在微珠上的双链DNA聚合物上形成大量的荧光CuNP,通过荧光测量实现目标DNA的高灵敏检测。本方法无需引入酶,操作简单,无需对发夹型DNA探针进行标记,目标DNA的检出限为0.4nM,且本方法对单碱基突变DNA具有良好的选择性。为了进一步提高本方法的灵敏度,我们将CdTe量子点引入检测体系,CuNP被水解后生成大量Cu2+,Cu2+可以有效淬灭CdTe量子点的荧光,使本方法的检出限进一步降低至90pM。
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