【摘 要】
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目前，昆虫杆状病毒载体表达系统是应用最为广泛的真核表达系统之一。其中，家蚕BmNPV病毒载体系统因其宿主家蚕可以大规模人工饲养，因而较AcNPV载体表达系统更适用于产业化应用。
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目前，昆虫杆状病毒载体表达系统是应用最为广泛的真核表达系统之一。其中，家蚕BmNPV病毒载体系统因其宿主家蚕可以大规模人工饲养，因而较AcNPV载体表达系统更适用于产业化应用。然而，对于BmNPV病毒载体系统来说，传统的同源重组构建重组病毒的方法因需要空斑法筛选纯化病毒而显得效率低，技术复杂且耗时费力。即使通过Bac-to-Bac系统构建重组病毒也需要2周左右。本研究拟通过构建复制缺陷型的BmBacmid穿梭载体以提高重组病毒构建和表达外源基因的效率。
本研究所构建的BmBacmid穿梭载体通过以下三步完成。首先，利用氯霉素表达盒通过Red同源重组的方法敲除杆状病毒复制必需基因orf1629部分序列，从而构建复制缺陷型的BmNPV载体RD-BmBacmid。然后，同样的方法利用gfp-ble表达盒敲除病毒p26、p10和p74基因，构建RD_BmBacmid△p10载体。最后，利用lacZ-Gen表达盒敲除BmNPV基因组中chitinase和cathepsin基因，构建RD_BmBacmid△p1O/chi/cath载体。
为了分析这些复制缺陷型BmBacmid载体构建重组病毒和表达外源基因的效率，本研究先利用红色荧光蛋白(DsRed)的转移载体pBacPAK8-DsRed与RD-BmBacmid共转染BmN细胞构建重组病毒，确证该载体的复制缺陷性并可用来正筛选获得重组病毒。继而，利用三种复制缺陷型载体分别构建重组病毒表达荧光素酶，通过测定荧光素酶的活性分析不同病毒载体表达荧光素酶的效率，发现相对RD-BmBacmid而言RD-BmBacmid△p10和RD-BmBacmid△P10/chi/cath的表达效率有明显提高。
因而，本研究成功构建复制缺陷型BmBacmid载体，可一步构建重组病毒，操作简便，省时省力，并能高效表达外源蛋白，为利用家蚕杆状病毒载体系统高效表达目的蛋白提供了新的途径。
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