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细胞外微环境在细胞的增殖、分化和组织的发生发育、恒常性维持以及损伤修复过程中都具有重要的生理功能,近年随着组织工程和再生医学研究的不断深入和突飞猛进的发展,细胞外微环境的仿生构建研究已成为生物学、医学以及材料学等多学科共同关注的焦点。仿生构建具有良好生理与生化特性的细胞外微环境不仅可以在体内外为细胞提供三维生长空间,同时其还可进一步参与调控细胞的表型表达及其结构/功能重建。本论文工作旨在依据生物学信息、利用材料学分子设计及静电纺丝成型加工技术仿生构建具有纳米纤维结构的三维多孔支架,系统研究了支架本体及表面结构、组成等物理、化学和生物学信号分子对内皮细胞/干细胞的黏附、增殖及诱导分化功能表达的调控机制,并进一步开发具有特异性组织诱导功能的新型生物活性材料,为组织工程和再生医学相关的细胞外微环境的仿生构建提供理论和实践指导。
论文工作中首先通过提高静电纺丝过程中接收转子的转速,制备了具有取向结构纳米纤维支架,并研究了其拓扑结构及表面生物亲和修饰对内皮细胞的增殖及分化功能表达等细胞行为的影响。扫描电镜(SEM)观察结果显示纳米纤维的取向结构整齐均一,且内皮细胞特异亲和性透明质酸的表面修饰未明显改变取向纳米纤维支架的物理结构。同时,傅立叶红外光谱分析表明低分子量的透明质酸共价接枝到了经氨解的聚己内酯(PCL)纳米纤维表面;该修饰使取向纳米纤维支架的表面接触角由105.2°变为39.3°,显著提高了支架表面的亲水性。该支架进一步用于内皮细胞培养,其细胞形态分析结果表明,取向的纳米拓扑形态可显著促进血管内皮细胞(HUVECs)的伸展,其表面的透明质酸改性可促进细胞的粘附。血管性血友病因子(vWF)的免疫荧光检测结果表明透明质酸修饰取向纳米纤维支架更有利于促进内皮功能性基因的表达并快速诱导类内皮层结构形成。
论文中还制备了控释血管内皮细胞生长因子(VEGF)的梯度纳米纤维(gCS/PCL)支架,进一步研究该控释体系对支架表面内皮化的影响。通过壳聚糖/聚己内酯质量梯度静电共纺技术制备壳聚糖梯度纳米纤维支架,后经共价键制备梯度肝素化纳米纤维支架,最终经生物亲和力进一步制备VEGF的梯度分布及其缓慢释放。本研究中利用荧光共聚焦显微镜、傅立叶红外光谱分析、ELESA检测及血小板黏附和抗凝血酶原时间测定等表征了所制备支架的理化学特性。结果表明,纳米纤维支架基质组分壳聚糖的梯度分布不仅提高了支架的肝素化程度,显著抑制血小板的黏附,改善了制假的抗凝血性能;同时实现了支架表面VEGF的生物亲和固定,与非梯度纳米纤维支架相比,在释放试验的最初12小时内,VEGF的突释现象明显被改善,可持续有效释放VEGF近1周。且内皮细胞的体外培养MTT实验和细胞骨架荧光染色实验表明,装载VEGF的梯度纳米纤维支架更有助于HUVECs的粘附和快速增殖,并形成致密的内皮细胞层。
论文的最后一部分工作是为仿生构建细胞微环境,通过基因工程技术构建了内皮细胞特异亲和性融合蛋白细胞外基质-VE-cad-Fc。分离扩增内皮细胞钙粘素胞外域并与免疫球蛋白Fc段进行基因融合构建了真核表达载体,通过细胞转染、蛋白表达和纯化获得VE-cad-Fc融合蛋白。Western blotting和ELEAS检测表明我们不仅成功生物合成了VE-cad-Fc融合蛋白,其分子质量约为90.3KD,且该融合蛋白均以二聚体的形式存在。VE-cad-Fc基质化表面培养内皮细胞,MTT和细胞骨架荧光染色结果表明,VE-cad-Fc融合蛋白可显有促进细胞的粘附和伸展,且其细胞黏附具有钙离子依赖性。实时荧光定量PCR基因表达分析显示,VE-cad-Fc融合蛋白基质上调细胞表面VE钙粘素的表达,进而引发一系列的胞内细胞信号,调控内皮细胞特异性功能基因的表达。流式细胞仪分析结果表明VE-cad-Fc融合蛋白基质使骨髓间充质干细胞向内皮细胞的诱导分化效率提高了1.8倍,即普通基质表面培养的15.3％上升到42.8%。利用Fc蛋白融合技术制备内皮细胞钙粘素基质化蛋白工程材料,实现了通过细胞间黏附分子改善细胞与细胞基质的特异性相互作用,促进内细胞增殖并调控成年干细胞向内皮分化的研究结果具有重大的理论和使用价值。