【摘 要】
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目的:蟹是常见的容易引起食物过敏的甲壳类动物之一。目前,大部分对蟹过敏原的研究主要集中于肌肉组织,尚未见有关蟹卵巢组织过敏原研究的相关报道。本研究的目的是期望以中
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目的:蟹是常见的容易引起食物过敏的甲壳类动物之一。目前,大部分对蟹过敏原的研究主要集中于肌肉组织,尚未见有关蟹卵巢组织过敏原研究的相关报道。本研究的目的是期望以中华绒螯蟹为研究对象,评估蟹卵巢组织作为潜在的过敏原来源的可能性,并分析其中的过敏原组分;对于新发现的一种过敏原进行重组表达并评估其免疫活性和生物活性。方法:中华绒螯蟹卵巢组织过敏原组分分析:采用裂解液提取法分别获得卵巢、肌肉组织的蛋白提取液,经SDS-PAGE分析卵巢、肌肉组织提取液成分的完整性,并采用Dot blotting比较二者与蟹过敏患者血清反应性;以蟹过敏患者血清中的s Ig E作为识别抗体,通过免疫印迹和2DE免疫印迹分析蟹卵巢组织提取液中的主要过敏原组分,并用MS/MS质谱技术鉴定主要过敏原蛋白成分,证实蟹卵巢组织作为潜在的过敏原来源的可能性。中华绒螯蟹卵巢主要致敏蛋白——卵巢发展蛋白EJO1(Eris 2)的重组表达及鉴定:首先,用Trizol法提取中华绒螯蟹卵巢组织总RNA,扩增获得Eris2基因片段,并连接p ET-28b(+)质粒构建重组质粒;其次,使用Rosetta(DE3)菌株将重组质粒进行重组表达,利用镍柱对目的蛋白进行纯化,获得r Eris 2蛋白;再次,通过ELISA、抑制ELISA、免疫印迹抑制试验、嗜碱性粒细胞激活试验等,验证r Eris 2与血清s Ig E的反应性及其活化致敏嗜碱性粒细胞的能力,初步证实r Eris 2可作为已知抗原用于蟹过敏的体外诊断。结果:中华绒螯蟹卵巢组织过敏原组分分析:SDS-PAGE结果证实裂解液提取法提取的卵巢和肌肉组织提取液蛋白成分完整。Dot blotting显示,患者血清中的s Ig E对蟹卵巢组织和蟹肌肉组织提取液的反应性不同。免疫印迹、2DE免疫印迹发现,分子量(molecular weight,MW)105 k Da、p I 7.5,MW 85 k Da、p I 8,MW 70 k Da、p I 5.5,MW 28 k Da、p I 6,MW 28 k Da、p I 6.2处的蛋白为蟹卵巢组织中能与蟹过敏患者血清反应的高发斑点区,经MS/MS质谱技术鉴定,确定卵黄蛋白原、血蓝蛋白、卵巢发展蛋白EJO1、卵巢发展蛋白EJO2为中华绒螯蟹卵巢主要过敏原。Eris 2的重组表达及鉴定:本研究构建并重组表达获得相对分子质量约为32000的r Eris 2蛋白。以r Eris 2为包被抗原的ELISA结果显示,r Eris 2与29例蟹过敏患者阳性血清的反应性明显高于6例阴性血清(P<0.05);抑制ELISA和免疫印迹抑制试验结果证实,r Eris 2可以抑制蟹卵巢组织提取液与蟹过敏患者血清之间的反应;嗜碱性粒细胞激活试验证实r Eris 2可激活蟹过敏患者外周血中的嗜碱性粒细胞脱颗粒,从而证明r Eris 2可作为一种重组蛋白用于蟹过敏原的检测。结论:本研究结果证实蟹卵巢组织含有多种过敏原组分,至少包括卵黄蛋白原、血蓝蛋白、卵巢发展蛋白EJO1(Eris 2)和卵巢发展蛋白EJO2。重组Eris 2蛋白,与s Ig E具有较好的反应性,能够作为血清s Ig E检测的抗原;同时Eris 2也可用于嗜碱性粒细胞激活试验,作为重要的激活剂,评估机体接触该过敏原或者该食物的风险程度。
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