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课题组的前期研究已尝试利用食品级生物活性肽——酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides,CPP)与活性多糖——壳聚糖(Chitosan,CS)构建活性物载体体系,系统研究了两者相互作用关系,并明确构建条件和步骤。本研究在前期研究基础上利用该载体体系包埋一种天然抗氧化、抗炎、抗肿瘤的活性大环二聚体鞣质——月见草素B(Oenothein B,OeB)。由于OeB是具有酯键及大量羟基的大环二聚体鞣质结构,它的加入也会影响酪蛋白磷酸肽-壳聚糖载体体系的构建,因此,本论文从研究三者相互作用出发,进一步指导OeB纳米载体小球的构建条件、方式,从而实现OeB的有效包埋。同时,优化了适合大规模生产的制备方法,对制备纳米小球的稳定性、缓释作用进行评价。最后研究了纳米小球在Caco-2细胞模型中吸收机制。研究内容与结果如下:(1)CPP/CS/OeB相互作用研究。通过改变CPP/CS/OeB三者比例、体系浓度,观察三者相互作用现象,采集粒径(Particle Size)、光强(Count Rate)、多分散性系数(Polydispersity)、浊度(Turbidity)等表征参数,绘制出三者相图,总结规律。研究发现,在只有CS和OeB的体系中,随OeB与CS质量比值的增大,体系经历溶液-溶胶-絮凝沉淀(Solution-Sol-Flocculation)转变,但在物质总浓度低于0.9 mg/m L时,两者相互作用现象不明显。在只有CPP和CS的体系中,体系随CPP与CS质量比值的增大经历溶液-聚电解质小球-颗粒状沉淀(Solution-Complex Coacervate-Precipitation)转变,该转变过程在很小的浊度下就可以发现;当两者比例不变时,随总浓度上升,参数粒径、光强值、浊度均呈上升趋势。在只有CPP和OeB的体系中,无论浓度高低,体系保持澄清透明状态。在CPP/CS/OeB体系中,存在四种状态:(1)溶液(Solution)、(2)聚电解质小球(Complex Coacervate)、(3)絮凝沉淀(Flocculation)、(4)颗粒状沉淀(Precipitation)。以四种状态为区域划分依据,在三角形坐标图中,绘制CPP/CS/OeB相图。对比CPP/CS/OeB相图发现,影响CPP/CS/OeB状态的主要因素为三者比例,浓度次之。以相图作为指导,从CPP/OeB/CS共同作用所形成聚合物的粒径、数量、体系稳定性等方面综合考虑,选择体系终浓度为1.4mg/m L,CPP/CS/OeB三者比例为3:3:1的条件制备聚电解质纳米小球,此时纳米小球粒径为156.1±2.2 nm,带电量22.02±1.3 m V,光强652.1±kcps、多分散性系数0.214。(2)OeB纳米小球制备工艺的优化。工艺流程为交联、离心、超声、真空冷冻干燥四个步骤。首先,本实验以粒径、光强、包封率、载药量为指标,研究了天然交联剂京尼平的添加量、作用时间对京尼平交联的OeB纳米小球(OeB-GNP)的固化效果的影响;其次,以上清液和纳米小球富集液的粒径、光强为指标,研究了离心力、离心时间对其分离、富集效果的影响;再者,以分析多分散性系数、粒径、光强、浊度为指标,研究了超声功率、超声时间对OeB-GNP的分散效果的影响;最后,以粒径及其分布为指标,利用扫描电镜图,研究真空冷冻干燥工艺对OeB-GNP形状的影响。结果表明,OeB-GNP的最佳工艺为:京尼平体系浓度为0.4 mg/m L,交联时间12h;离心条件为13400g,30min;超声条件为100W,45min。工艺优化后所得OeB-GNP参数为:粒径范围170~290 nm,Count Rate范围为500~700 kcps,带电量18.06±1.8 m V,多扩散系数0.200±0.05,OeB包封率为99%,载药量为15%。(3)OeB-GNP控释效果及稳定性评价。以OeB的保留率和纳米小球中OeB释放率为指标,研究p H、温度、时间、人工模拟胃肠液、消化酶液环境的变化对OeB稳定性和OeB-GNP控释效果的影响;其次,以粒径、光强、多分散性系数、浊度为指标,研究了p H、温度、贮存时间、溶液环境的变化对纳米小球性状的影响;最后,以荧光值为指标,使用多功能酶标仪和荧光倒置显微镜分析OeB-GNP清除活性的能力。结果表明,在p H 1.2~7.0、温度4~25℃条件下以及不同溶液环境中交联纳米小球性状稳定。在人工模拟胃肠液和两种消化酶液中,交联纳米小球中OeB释放率随时间的变化而不同,均在10%以内,其中,在人工模拟胃液中释放率最低,为0.2%~0.6%,在人工模拟胃液中释放率最高,为0.4%~9.6%,被包埋的OeB得以缓释和保护,相反,空白对照未包埋的OeB稳定性差。细胞抗氧化能力研究方面显示,OeB-GNP具有一定的抗氧化活性,并呈现良好的剂量-效应关系,但效果不如未包埋的OeB。当CAA值达到50时,OeB-GNP中OeB的质量浓度为0.117 mg/m L,而未包埋的OeB质量浓度为0.024 mg/m L。(4)OeB-GNP吸收效果的评价。本文成功地建立Caco-2细胞模型,并考察OeB-GNP在Caco-2单层细胞的摄取和转运特征,评价其在肠道的吸收效果。利用倒置荧光显微镜观Caco-2细胞摄取效果,发现OeB-GNP能很好地附着在Caco-2细胞表面。利用采用高效液相色谱法(HPLC)检测OeB和OeB-GNP转运后BL侧OeB的转运量,均未能检测到OeB。但利用动态光散射法检测OeB-GNP转运后BL侧的表征参数,发现随转运时间的延长和转运浓度的增大,BL侧样液的Count Rate值增大,粒径分布主要范围在80~105 nm,表明OeB-GNP能以整体形式透过细胞模型。