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脱落酸[S-(+)-abscisic acid，ABA]是重要的植物生长调节剂，在农林业生产等领域具有广阔的应用前景。通过对丝状真菌灰葡萄孢霉菌（Botrytiscinerea）的液体发酵已经实现了ABA的规模化生产，但是到目前为止对真菌中ABA的生物合成机理及调控机制的研究还比较有限。为了进一步揭示B.cinerea中ABA生物合成和代谢调控的分子生物学机制，本论文首先通过比较转录组学的方法分析了ABA高产灰葡萄孢霉菌突变菌株B.cinerea TBC-A及其出发菌株B.cinerea Bc-6在液体发酵过程中全基因组基因的表达变化规律;构建了用于在B.cinerea中通过农杆菌侵染法进行分子遗传学操作的工具载体;通过基因过表达和基因沉默的方法分析了ABA合成基因簇上的bcaba3、bcaba4基因和真菌次级代谢全局调控因子bclaeA1对B.cinerea中ABA合成或调控的影响;根据比较转录组学数据和生物细信息学分析的结果预测了ABA合成基因簇上功能未知的bcaba3基因可能的生物学功能并通过体外酶活实验确定了BcABA3为真菌ABA生物合成途径上关键的倍半萜环化酶。论文共分为3章。 第一章:比较转录组学分析灰葡萄孢霉菌突变株Botrytis cinerea TBC-A的ABA高产机制 本实验室具有用于工业化发酵生产ABA的B.cinerea突变株TBC-A及其出发菌株Bc-6，且已经对ABA高产突变株TBC-A进行了全基因组测序。在此基础上本研究采用转录组测序（RNA-Seq）的方法对ABA高产突变株TBC-A和出发菌株Bc-6进行比较转录组学研究，目标是揭示突变株TBC-A相比较于Bc-6菌株ABA产量大幅提高的分子机制。 以工业化发酵生产ABA的高产菌株B.cinerea TBC-A和其诱变前的出发菌株B.cinerea Bc-6为研究材料，根据ABA在B.cinerea液体发酵过程中的产生规律，选择了发酵过程菌株生长调整期、对数生长期和稳定期共12个时间点的样品，提取总RNA后进行全转录组测序。通过对高产菌株TBC-A和出发菌株Be-6的比较转录组学分析，探讨了高产突变株TBC-A中ABA高产代谢的分子机制。分析结果发现:TBC-A菌株次级代谢途径中ABA合成基因簇上bcaba1-4基因的表达水平相对于出发菌株Bc-6均有大幅度的上调;ABA前体化合物FPP的合成途径上的相关基因相对于出发菌株Bc-6有不同程度的上调表达;初级代谢途径中与ABA合成前体乙酰CoA有关的代谢途径如糖酵解途径、磷酸戊糖途径及乙酰CoA的合成转运等相关途径上的基因相对于Bc-6菌株也有不同程度的上调表达;另外发现数十个与菌体碳源利用相关的糖苷水解酶类和糖转运蛋白的编码基因在高产菌株TBC-A中也发生了较大程度的上调表达。综合比较转录组分析的结果，高产菌株TBC-A从碳源利用到乙酰CoA合成、从萜类骨架合成到ABA生物合成的一系列代谢途径上基因的表达水平都得到了加强。本研究初步揭示了高产突变株TBC-A相较于Bc-6菌株ABA产量提高上千倍的分子机制。 第二章:组装基于农杆菌侵染法转化B.cinerea进行分子遗传学操作的工具载体 通过比较转录组学筛选出可能参与ABA合成或调控的基因后需要通过基因过表达、沉默或敲除的方式进行目标基因的体内功能研究，前提是选择高效稳定的遗传转化体系和与转化体系相匹配的工具载体。目前在B.cinerea中应用最广泛的转化方法是原生质体转化法，但由于原生质体制备过程繁复而且本实验室的ABA产生B.cinerea菌株产生的孢子偏少，原生质体的得率和再生率都很低，因此本研究采用农杆菌侵染法这一转化效率高且操作简便的转化方法进行B.cinerea菌株的分子遗传学操作。 目前针对通过农杆菌侵染法在B.cinerea菌株中进行基因表达、沉默和敲除操作所需工具质粒的报道较少，本研究通过In-Fusion assembly的方法将pLOB7、pBHt2、pBARKS1、pUC19、pCAMBIA-1300-221和pSilent-1等原始载体进行拼接组装，构建成功用于农杆菌侵染法转化B.cinerea的过表达载体pCBg1、PCBh1、沉默载体pCBSilent1和敲除载体pCBKO1。通过将报告基因eGFP导入这些工具载体验证了它们在B.cinerea中的工作效率:转化pCBg1-eGFP和pCBh1-eGFP的B.cinerea菌株能够高效表达GFP;将pCBSilent1导入已转化pCBg1-eGFP的B.cinerea突变株能够有效地降低GFP的表达效率。 第三章:ABA合成和调控相关基因（bcaba3、bcaba4和bclaeA1）的体内功能研究和BcABA3蛋白的体外酶活功能研究 1.Bcaba3基因在Bc-6菌株中的过表达研究 Bcaba3基因为ABA合成基因簇上功能未知的基因，比较转录组学分析的结果发现在液体发酵过程中bcaba3基因在高产菌株TBC-A中的表达量比出发菌株Bc-6提高了几十倍，而且bcaba3在TBC-A菌株发酵过程稳定期的表达量比对数生长期提高了200多倍。为了确定bcaba3基因的功能，本论文首先利用上述改造完成的工具质粒将bcaba3基因在出发菌株Bc-6中通过基因过表达的方式进行体内功能研究。HPLC检测结果发现转bcaba3基因的Bc-6菌株中ABA的产量得到了明显的提高，说明bcaba3基因的表达水平与B.cinerea的ABA产量正相关。 2.BcABA3蛋白的体外酶活功能研究 由于比较转录组学分析的结果在B.cinerea的基因组中未发现与bcaba1-4表达模式类似的其他基因簇，因此推断功能未知的bcaba3基因可能编码B.cinerea中ABA生物合成的关键酶倍半萜环化酶。为了通过体外酶学实验探索BcABA3是否可以催化FPP的环化反应，本研究利用原核表达系统表达纯化了BcABA3重组蛋白，在体外酶活实验条件下确认了BcABA3能够催化FPP的环化反应，通过GC-MS检测到了环化反应产物2Z，4E-α-芷香乙烷和相关的反应中间体。本研究确定了BcABA3蛋白的生物学功能是B.cinerea中ABA生物合成的关键步骤——FPP脱膦酸、异构和环化反应的催化酶。 3.Bcaba4基因对ABA合成代谢的影响研究 敲除ABA合成基因簇上可能编码短链脱氢酶的bcaba4基因并不能阻断B.cinerea中ABA的生物合成，而且bcaba4基因在高产菌株TBC-A液体发酵过程中的表达丰度明显小于bcaba1、bcaba2和bcaba3。为了探索bcaba4的表达丰度与ABA合成的关系，本论文通过基因过表达和基因沉默的方式研究了bcaba4基因对B.cinerea中ABA合成代谢的影响。HPLC检测发现过表达bcaba4的出发菌株Bc-6中ABA的产量得到了提高。采用基于形成发夹RNA结构的基因沉默方法，对ABA生产菌的bcaba4基因进行了特异性沉默，检测结果发现bcaba4基因沉默后的B.cinerea菌株中ABA的合成量明显降低。这些结果证明了bcaba4基因的高表达对B.cinerea的ABA高产代谢同样具有重要的作用。 4.BclaeA基因对B.cinerea中ABA合成的调控作用 另外本论文研究了真菌次级代谢全局调控因子bclaeA1基因对B.cinerea中ABA合成的调控作用。检测结果发现在暗培养条件下过表达bclaeA1的出发菌株Bc-6中ABA的产量得到了明显提高，而且bclaeA的两种剪接异构体对出发菌株Bc-6中ABA产量的提升具有相同的作用，但是过表达bclaeA1的ABA高产菌株中ABA的产量却明显下降。这些结果说明次级代谢全局调控因子bclaeA对B.cinerea中ABA的合成具有一定程度的正向调控作用，但ABA高产突变菌株TBC-A中ABA的产量比出发菌株Be-6提高上千倍这一现象与bclaeA1的调控作用之间的关系还需进一步研究。 本论文的创新点: 1.通过比较转录组学的方法进行了ABA高产突变菌株TBC-A和出发菌株Bc-6在液体发酵过程中全基因组基因的表达差异分析;通过分析高产菌株TBC-A中与ABA合成相关的代谢途径上基因的表达变化规律初步揭示了ABA高产代谢的分子机制。 2.构建了用于在B.cinerea中通过农杆菌侵染法进行分子遗传学操作的表达载体、沉默载体和敲除载体，为该菌的分子生物学研究提供了有效的工具。 3.通过采用基因过表达、沉默或敲除的方法，分析了ABA合成基因簇上的bcaba3、bcaba4基因和真菌次级代谢全局调控因子bclaeA1基因对B.cinerea中ABA合成或调控的影响。确认了bcaba3和beaba4基因的表达水平与B.cinerea的ABA产量成正相关而bclaeA基因对B.cinerea中ABA的生物合成具有一定程度的正向调控作用。 4.根据比较转录组学分析的结果推断并通过体外酶活实验验证了BcABA3为催化B.cinerea中ABA合成途径关键步骤（FPP脱膦酸、异构和环化）反应的倍半萜环化酶。 综上，本研究初步揭示了突变菌株B.cinerea TBC-A中ABA高产代谢的分子机制并明确了关键的合成基因，为下一步构建基因工程菌进一步提高脱落酸的产量提供了理论依据。