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松材线虫Bursaphelenchus xylophilus(Steiner& Buhere,1934),是国际上公认的重要检疫性有害生物。随着分子生物学研究的深入,运用分子生物学技术研究其致病机理以及寻找控制该病害的方法成为可能。本文以松材线虫精氨酸激酶基因BxAK1和BxAK2为研究对象,首次在松材线虫中获得精氨酸激酶基因BxAK1和BxAK2基因编码区DNA序列,并用RNAi和半定量RT-PCR的方法初步研究了基因BxAK1和BxAK2的功能。主要结果如下:
1.首次获得松材线虫精氨酸激酶编码基因BxAK1和BxAK2的编码区DNA全长序列。BxAK1基因的DNA编码区序列全长为2430bp,编码区内含有的4个内含子将编码划分为5个外显子;4个内含子的大小分别为421bp、117bp、475bp和268bp,5个外显在的大小分别为57bp、207bp、309bp、360bp和215bp;BxAK2基因的DNA编码区序列全长为2570bp,编码区内含有的3个内含子将编码划分为4个外显子;3个内含子的大小分别为635bp、479bp和220bp,4个外显子的大小分别为99bp、288bp、339bp和510bp。BxAK1和BxAK2基因的外显子和内含子交接处的边界序列都遵循“GT/AG”规则。
2.利用dsRNA浸泡的方法对松材线虫的BxAK1和BxAK2基因进行沉默。观察到两个基因的处理,在不同时间的处理,松材线虫形态发生变化,开始阶段处理后的线虫表现出活动减缓,4h后开始变成环状,12h后线虫校正死亡率分别为97.93%和98.60%,48h大部分已经死亡,校正死亡率分别为99.70%和99.33%。60h后,部分死亡的线虫已经分解;而松材线虫的卵,经过干涉后明显发育迟缓,或者停止发育。并观察到干涉对繁殖率的影响也很大,接种到盘多毛孢8d后,BxAK1和BxAK2基因的dsRNA处理后的松材线虫的繁殖量分别减少了68.3%和60.1%。
3.半定量RT-PCR检测结果表明:被dsRNA干涉后的BxAK1和BxAK2基因在转录水平都明显降低或者不表达。
这是国内外首次对松材线虫的BxAK1和BxAK2基因功能的研究报道,为建立利用RNAi技术防控松材线虫的新方法打下基础。