论文部分内容阅读
聚羟基脂肪酸酯(PHAs)是很多细菌和嗜盐古菌在营养不平衡的条件下积累的胞内聚酯，作为碳源和能源的贮存物。PHAs不仅具有热塑性塑料的性质，还具有生物可降解性、生物相容性等高附加值性能，其广阔的应用前景吸引了越来越多研究者的关注。嗜盐古菌作为PHAs的生产菌株具有很多细菌不可比拟的优势。然而，嗜盐古菌PHAs代谢中关键酶及关键途径的研究还不充分。因此，本文以嗜盐古菌中最具潜力的聚羟基丁酸羟基戊酸共聚酯(PHBV)的生产菌株地中海富盐菌Haloferax mediterranei为研究对象，解析该菌株PHBV代谢的关键酶及关键途径。本研究主要内容包括： ⑴H.mediterranei在不添加3-羟基戊酸(3HV)相关前体的培养条件下，利用非相关碳源能够合成3HV含量约为10 mol％的PHBV。3HV单体的重要前体丙酰-CoA的合成途径一直是困扰本领域研究者的重要问题。基于该菌的基因组序列预测了四条可能的丙酰-CoA合成途径，包括甲基苹果酸/2-酮丁酸途径、天冬氨酸/2-酮丁酸途径、甲基丙二酰-CoA途径以及3-羟基丙酸途径。其中，3-羟基丙酸途径在积累PHAs的细菌以及嗜盐古菌中从未有过报道。途径中间代谢物的添加以及关键基因的失活证实这四条途径确实为3HV单体的合成提供丙酰-CoA。13C标记实验确证了新发现的3-羟基丙酸途径可以将CO2固定到PHBV中。13C代谢流分析表明甲基苹果酸/2-酮丁酸途径和3-羟基丙酸途径是主要的丙酰-CoA供应途径，分别提供53.0％和30.6％的通量。基因芯片分析表明在PHA合酶缺失菌株△phaEC中，上述四条途径中很多编码基因的转录都发生了下调。这些实验结果证实H.mediterranei利用非相关碳源合成PHBV时，至少存在四条丙酰-CoA供应途径，包括一条新发现的3-羟基丙酸途径。 ⑵H.mediterranei利用非相关碳源合成丙酰-CoA的途径已经得到了阐明，催化乙酰-CoA和丙酰-CoA缩合为PHBV前体的β-酮硫解酶的解析则成为嗜盐古菌PHBV合成途径的一个关键问题。因此，我们对H.mediterranei中PHBV合成特异的β-酮硫解酶进行了研究。H.mediterranei的基因组中存在8个可能的β-酮硫解酶编码基因。结果表明，其中两个β-酮硫解酶（PhaA和BktB）参与了PHBV前体合成，它们都由共转录的两个基因编码;而细菌中PHA合成特异的β-酮硫解酶均只由一个基因编码。BktB既能催化两分子乙酰-CoA的缩合，也能催化乙酰-CoA和丙酰-CoA的缩合;而PhaA只能催化两分子乙酰-CoA的缩合。PhaA和BktB的大亚基决定底物特异性，其催化位点“Ser-His-His”不同于细菌中的“Cys-His-Cys”。小亚基含有一个OB fold结构域，对于β-酮硫解酶的活性不可或缺。体内实验表明，PhaA和BktB的小亚基可以互换，但它们会优先与各自的大亚基形成有功能的酶。这些实验结果证实H.mediterranei中PHBV合成特异的β-酮硫解酶是由大小两个亚基组成的新型PhaA/BktB。 ⑶对H.mediterranei利用非相关碳源合成PHBV的途径有了较全面的了解。在外部碳源匮乏时，PHBV会被胞内酶系降解成小分子化合物作为碳源和能源，其中重要的小分子物质丙酰-CoA的利用对嗜盐古菌具有重要的生理意义，但该过程的关键酶仍然未知。生物信息学分析表明H mediterranei基因组中存在丙酰-CoA羧化酶(PCC)可能的编码基因:一个生物素羧化酶和生物素羧基载体蛋白的编码基因(pccA)，两个羧基转移酶编码基因(pccB和yccB)以及一个与pccB共转录的功能未知的pccX基因。遗传学实验结合酶活实验证实H.mediterranei中的PCC由PccA、PccB和PccX亚基组成，不同于嗜热古菌中PCC的亚基组成。DBX菌株（pccBX基因簇的敲除菌株）失去了利用丙酸的能力，而且胞内积累过量的丙酰-CoA，这些结果说明PCC对于丙酰-CoA的利用不可或缺。有意思的是，DBX菌株表现出一系列表型特征，包括细胞生长减缓、葡萄糖消耗减少、PHBV合成量降低和细胞表面褶皱。体外酶活实验表明丙酰-CoA会抑制琥珀酰-CoA合成酶的活性。基因芯片分析表明DBX菌株中很多与糖酵解、PHBV合成、电子传递和应激相关的基因的转录都受到了影响。这些结果证实H.mediterranei中由PccA、PccB和PccX亚基组成的PCC为古菌中新型的PCC，它对于丙酰-CoA的利用是不可或缺的，并且丙酰-CoA代谢的扰动会影响细胞全局代谢。 ⑷H.mediterranei的PHBV代谢途径已经得到了系统的解析。那么，该菌将生物质转化为PHBV的能力如何呢？几丁质是自然界第二丰富的生物质材料，在本论文中，我们研究了H.mediterranei对几丁质的生物转化能力及几丁质降解的关键基因。摇瓶培养实验表明，H.mediterranei可以有效利用胶体几丁质或者粉末几丁质生长并积累PHBV。该菌基因组中存在一个可能的几丁质降解基因簇。RT-PCR表明，基因簇中几丁质酶基因(chiA、chiB、chiC和chiD)、类LmbE去乙酰化酶基因（dac）和糖苷酶基因(glyA)的表达受胶体几丁质或粉末几丁质诱导，而且相邻的chiA、chiB、chiC基因共转录。遗传学实验证实ChiABCD、Dac和GlyA共同参与了H.mediterranei降解几丁质的过程。另外，几丁质酶活实验表明四个几丁质酶均能降解胶体几丁质和粉末几丁质，胶体几丁质经ChiABCD水解的主要产物是几丁二糖。推测几丁二糖经Dac、GlyA或其它相关的酶进一步降解成单糖，用于细胞生长以及PHBV的积累。