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细菌“活的非可培养状态”自20世纪80年代发现至今，一直是预防医学、流行病学、微生物生态学以及公共卫生检验检疫方面研究的热点问题之一。因为进入VBNC状态的病原菌在不良环境中，不但丧失了在培养基上生长繁殖的能力，而且具有与原菌相似的致病性，成为可以逃避检测的“隐性”传染源，对周围的环境及人类安全构成潜在威胁。目前，国内外对VBNC研究多集中上述领域，可以范围相对狭窄，所涉及的细菌种类也有限，仅局限于自然环境中的致病菌，并以G~-菌居多。现在已确知，至少有40多种细菌存在VBNC状态，但尚未见到“益生菌”存在VBNC状态的报道。为了补充、扩大具有VBNC状态的细菌种类与数量，本研究以不同来源的乳酸杆菌和大肠杆菌作为研究对象，首先筛选确定了诱导VBNC状态的因素；其次利用平板计数、吖啶橙和LIVE／DEAD试剂荧光染色直接计数以及流式细胞仪检测等对VBNC状态进行了检测与观察；再次对VBNC细菌进行了复苏实验；最后又对正常与VBNC状态乳酸杆菌的主要生物学特性进行了比较。研究结果表明：1、大肠杆菌E1和E2在含有2％冰醋酸的LB培养基中，于4℃需氧培养，可分别在12天和22天后进入VBNC状态，并分别于72天和60天后丧失该状态。2、乳酸杆菌R1、R2和R3于4℃，在pH为2.0～3.0的MRS培养基中进行厌氧培养时，可分别在第41天、35天、46天后进入VBNC状态，其中R1和R3均在第65天后丧失VBNC状态，而R2在100天后仍能维持该状态。3、不同来源的大肠杆菌E1和E2，乳酸杆菌R1、R2和R3，诱导和维持VBNC状态所需时间均不相同，而时间长短与原菌自身生理特性及对外界环境抵抗能力成正相关。4、Tween-80可将处于VBNC状态的大肠杆菌和乳酸杆菌恢复为可培养状态，实现复苏。一般地，刚进入VBNC状态的细菌易被复苏，但已经由VBNC状态转入真正死亡状态的细菌复苏能力丧失。5、正常状态的乳酸杆菌R2不但对酸有较强的耐受性，而且还对0.2％的胆盐和1％的胃蛋白酶有耐受性。相比之下，VBNC乳酸杆菌R2对强酸、1％胃蛋白酶都具有较强耐受性，但对胆盐则不耐受。除此之外，为了探讨细菌VBNC状态的发生机制，本研究根据大肠杆菌基因组中高度重复出现的短序列，设计了用于原核细胞mRNA差异显示技术(DD-RTPCR)的引物，并利用这项技术，经DDRT-PCR、普通琼脂糖及PGEG电泳、银染、克隆、反向Northern杂交、序列测定及Blast检索等，共获得3个同源性较高的差异片段(A1、A2和C1)。研究结果表明：1、所获3个差异片段(A1、A2和C1)均为VBNC大肠杆菌所表达的基因，而非正常状态大肠杆菌表达基因，为差异基因。2、3个差异片段均与8株不同大肠杆菌的基因组DNA克隆(AP009048.1、U00096.2、AE014075.1、CP000468.1、V00331.1、AF053966.1、U18997.1、J01695.1)具有较高的核苷酸同源性，其中C1最高，高达99％；A1和A2次之，但两者也均在98％以上，说明所获序列为大肠杆菌基因。3、3个差异片段与上述8株不同大肠杆菌的23s核糖体RNA的氨基酸同源性高达97％以上，表明这3个序列是大肠杆菌23s核糖体rRNA基因的部分序列，可能参与VBNC状态下的基因转录或核糖体大亚基的自身构成。4、实验所获3个差异片段不仅与大肠杆菌23srRNA基因高度同源，而且还与志贺氏菌属和沙门氏菌属中的细菌23srRNA基因高度同源，同源性均在92％以上，而同源性的高低与种属亲缘关系远近密切相关，表明实验所获序列是一个比较保守的基因，并且广泛存在于与大肠杆菌及其相近的种属之中。5、正常大肠杆菌在未暴露任何压力下时，其转录水平较低，特别是23srRNA的某一(些)基因不表达或表达量极低。当进入VBNC状态后，面临生存压力时，大肠杆菌转录水平增加，而核糖体作为蛋白质合成的主要结构与场所，其某些基因将积极参与新蛋白质的生合，由此推知实验所获3个基因可能参与VBNC状态的发生及相关新蛋白的合成。