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硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Heparansulfateproteoglycan)中的硫酸乙酰肝素糖链是肿瘤生长所必需的。肿瘤中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖以生长因子共受体(co-receptor)角色介导生长因子信号传导从而促进血管生成和肿瘤的生长。硫酸乙酰肝素类似物理论上可以竞争性地抑制硫酸乙酰肝素与功能性蛋白质的结合,进而可能抑制生长因子依赖的信号传导而抑制血管生成和肿瘤生长。近年来,硫酸乙酰肝素与蛋白质的相互作用已成为药物开发的一个热点。目前临床中使用的血管生成抑制剂类药物均为靶向血管内皮生长因子A(VEGFA)信号的,在临床中这些药物确实改善了病人的生存质量,不幸的是它们也会引起副作用和耐药性,这说明开发基于新机制的血管生成抑制剂是急切需要的。为此,本研究拟制备硫酸乙酰肝素类似物并采用正向化学遗传学的方法揭示硫酸乙酰肝素类似物抗血管生成的作用机制。
天麻(GastrodiaelataB1.)是一著名传统中药,其中多糖主要由葡萄糖组成,但是其中多糖的一级结构未见报道。为此,我们提取、分离、纯化了天麻多糖并得到两个均一多糖AGEW和WGEW。它们的一级结构经过糖组成分析、甲基化分析和NMR等分析确定其主链为α(1→4)连接的葡聚糖,并具有α(1→4)连接的葡聚糖支链；二者的差别在于分枝度的不同,其中AGEW每16个糖有一个分枝,WGEW每18个糖有一个分枝。同时以氯磺酸.吡啶法分别制备了AGEW的硫酸化衍生物AS25和AS45及WGEW的硫酸化衍生物WSS25和WSS4.5。经NMR和红外光谱分析发现前述四个硫酸化多糖的硫酸基的取代均主要发生在0-6上。
采用正向化学遗传学的方法研究前述硫酸乙酰肝素类似物中WSS25对血管生成的作用及作用机制。我们发现WSS25在25μg/mL的剂量下就几乎完全抑制人表皮微血管内皮细胞HMEC-1在基质胶上的管腔形成并能显著地抑制HMEC-1细胞的迁移。血管生成芯片测试结果表明WSS25能够显著地下调HMEC-1中Id1的表达,而且使用Id1shRNA抑制HMEC-1中Id1表达后HMEC-1在基质胶上的血管生成被抑制,因此推断其为WSS25可能的作用靶标。但Id1是一核定位的转录因子,应当不是WSS25作用的直接靶分子。因Id1是血管生成促进因子BMP2的经典下游效应分子,WSS25极有可能是通过直接作用于BMP2而影响Id1的表达进而抑制血管生成。研究表明WSS25确实可以阻断HMEC-1中BMP2启动的BMP/Smad信号传导,而且石英晶体微平衡分析结果证实WSS25与BMP2具有强烈的相互作用。更重要的是,研究发现WSS25既可抑制BMP2诱导的HMEC-1在基质胶上的管腔形成又可抑制植入C57BL6小鼠的基质胶栓塞中BMP2诱导的血管生成。同时,我们也证明BMP2内源性的拮抗剂noggin也可以抑制BMP2诱导的HMEC-1在基质胶上的管腔形成。这说明WSS25确实是直接靶向BMP2而抑制Id1的表达从而抑制血管生成。我们进一步研究了WSS25体内的抗肿瘤作用,结果显示WSS25(100mg/kg)可以显著地抑制裸鼠中人肝癌细胞移植瘤的生长,同时给药组瘤组织中CD31和Id1的表达水平明显低于对照组瘤组织。这说明WSS25的肿瘤抑制作用是通过抑制Id1的表达引起的血管生成抑制实现的。
miRNA对血管生成具有调节作用,目前已经发现20多个具有血管生成调节作用的miRNA。为此,我们以差异表达谱的方法研究了WSS25对HMEC-1中具有血管生成调节作用miRNA的表达影响,以期从miRNA的角度阐释WSS25抗血管生成作用的机制。结果发现WSS25可以下调促进血管生成的miR-378和miR-210的表达,而上调抑制血管生成的miR-20a的表达。同时,我们还获得了FDA批准用于癌症临床治疗的血管生成抑制剂SU11248处理后的HMEC-1中miRNA表达谱。因SU11248和WSS25均可抑制血管生成,所以二者共同上调或者下调的miRNA就极有可能是具有血管生成调节作用的miRNA,它们上调了miR-129-5p、miR-210、miR-638和miR-1249的表达,下调了miR-885-3p的表达,其中miR-210的血管生成调节作用已被确证,因此其余四个miRNA也极有可能具有血管生成调节作用。
综上所述,本研究首先成功地制备了硫酸乙酰肝素类似物并幸运地发现其中的WSS25能够强烈地抑制血管生成这一表型,进而找出了WSS25上游作用靶标BMP2和下游效应因子Id1并在体内证实WSS25能够抑制制肝癌移植瘤的生长；同时也找出了受WSS25调控的miRNA,即miR-210、miR-378和miR-20a。更有意思的是,通过与Su11248引起的HMEC-1中miRNA差异表达谱的比较还发现了四个极有可能具有血管生成调节作用的miRNA。因此,本研究不仅揭示了硫酸乙酰肝素类似物抗血管生成作用的新机制同时也为血管生成疗法提供了新的候选药物分子。