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单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes, LM)是一种人畜共患的兼性细胞内寄生菌,并且是20世纪末世界卫生组织WTO列为四种最重要的食源性病原微生物之一,分布广泛,易感人群较多,可引起人类和动物的脓血症、流产、脑膜炎和胃肠炎等临床症状,同时也可以引起流产及通过胎盘引起新生儿的脓血症。其中InlA基因是LM的重要的毒力基因,InlA(内化素A)由800个氨基酸残基组成,为LM入侵人上皮细胞所必需,其受体为E-钙粘素,是最早鉴定出的与细菌侵袭相关的毒力因子,为被非吞噬细胞内化所必需,是LM所特有,不存于非致病性LM膜表面。制备针对单增李斯特菌膜表面蛋白InIA的高亲和力高特异性的抗体是建立研究LM侵入细胞时InlA各段蛋白重要性的基础。本研究通过克隆单核细胞增生李斯特氏菌特异性的膜表面蛋白InternalinA (InlA),获得LM特异性的膜表面蛋白InlA抗体,分析其氨基酸组成和蛋白结构,经免疫家兔获得多克隆抗体,从而分段制备LM特异性的抗体。为研究与分析InlA蛋白入侵细胞时各段相关蛋白发挥的作用奠定了物质基础。利用生物软件设计单核细胞增生李斯特氏菌InlA基因的引物,PCR扩增获得LM08-5923株InlA基因片段,测序后利用Genbank对InlA氨基酸序列的描述进行分段,分为2个基因片段InlA-1(1bp-1488bp)和InlA-2(1315bp-2403bp)分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,将重组质粒与分子伴侣质粒pG-KJE8共同转化到BL21中,并用终浓度为lmg/mL L-β可拉伯糖和lmmol/L的IPTG进行分步诱导表达,通过SDS-PAGE电泳分析表达产物。纯化表达产物后免疫家兔,并分别制备其多克隆抗体。间接ELISA检测多抗的效价及制备的多克隆抗体与天然InlA反应性,Western blot分析制备的抗体与表达产物和天然InlA反应性。选取4-7周龄BALB/C雌鼠25只随机分为5组(PBS组、攻毒组、免疫InlAl组、免疫InIA2组和免疫lnlA1+InlA2组),免疫组用纯化后的蛋白InlA1、InlA2及两种一起免疫小鼠,3免后14天给予灌胃LM(接种量约109CFU/mL),同时给予攻毒组和PBS组同样条件的灌胃,灌胃后60h后处死小鼠,无菌取出小鼠大肠段,无菌PBS冲后匀浆处理,再将匀浆后的液体按浓度倍比稀释,涂布与BHI (L+G)平板上通过菌落计数法计数比较定量口服LM后大肠上皮细胞内LM定植情况,分析InlA各段蛋白在侵入细胞时的作用。结果：成功借助阳性质粒与分子伴侣质粒pG-KJE8表达系统分段表达了InlA蛋白,融合表达产物分子量分别约为79ku和64ku,经GST-SefinoseTM Resin蛋白纯化试剂盒纯化后采用western blot分析,结果显示2段重组蛋白均分别能与2段重组蛋白制备多克隆抗体反应,在预期位置可见特异性条带,具有反应原性；免疫家兔获得的抗血清效价分别为InlA2(new flag)组兔血清效价最高为1:4096000, InlA1(LRRs)组兔血清效价最高为1：1024000；制备的多抗均可以与单增李斯特菌InlA天然蛋白发生反应,间接ELISA结果表明,2种重组蛋白均能够有效诱导抗体反应。动物实验结果表明免疫组攻毒后LM回收水平明显低于攻毒组,而InlA1免疫组攻毒后LM回收水平低于InlA2免疫组,说明InlA1(LRRs)段在LM侵入非吞噬细胞时发挥主要作用。