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目的心血管疾病是当今威胁人类健康和生命的主要疾病之一,心肌缺血是心血管疾病的主要因素。针刺用于防治心肌缺血已有数千年的历史,具有操作简便快捷、疗效确切的特点,但其作用机制尤其是分子生物学机制目前尚不完全清晰,在一定程度影响了针灸在心肌缺血临床的应用及推广。相关研究表明,在心肌缺血的过程中存在普遍心肌细胞凋亡表现,而细胞凋亡是受基因严格控制的,其中Micro RNA(miRNA)的调控具有关键作用。针刺是否是通过miRNA基因调控途径干预心肌细胞凋亡?主要是通过什么miRNA基因调控的?主要的miRNA基因是通过什么信号调控途径发挥作用的?这些都是需用研究的问题。有据于此,本课题选用心肌缺血模型大鼠为研究对象,在中医针灸“治未病”理论为指导下,采用“标本配穴”电针干预方法,以细胞凋亡为切入点,运用miRNA基因芯片筛选、实时荧光定量PCR(q RT-PCR)及蛋白质印迹(Western blot)等技术,观察心肌细胞凋亡相关miRNA及其靶基因表达的影响及调控关系,探讨“标本配穴”针刺干预心肌缺血的miRNA基因调控机制,以期为针刺防治心肌缺血疾病提供理论支撑和科学依据。方法1.选用SPF级雄性Wistar大鼠40只,体重180-220g,随机分为正常组、模型组、内关电针组(内关组)、标本配穴电针组(标配组),每组10只。模型组、内关组、标配组大鼠予异丙肾上腺素(ISO)2mg/(kg·d)腹部皮下注射,连续14天,后用BL-420生物机能系统检测模型组大鼠心电图,以QRS波、QT波持续时间延长(QRS>0.1s)、T波形态改变作为造模成功标志。正常组大鼠给予等量0.9%生理盐水腹部皮下注射,连续14天。正常组、模型组大鼠只抓取固定,不针刺治疗。内关组针刺双侧“内关”(大鼠腕横纹正中上5 mm,针刺深约0.5 cm),标配组针刺双侧“内关”、“关元”(大鼠脐下约25 mm,针刺深约0.5 cm)、双侧“足三里”(大鼠膝关节后外侧、腓骨小头下约5mm,针刺深约0.8 cm),标配组同侧穴位组成一对电极,内关组及标配组中内关穴在穴位右旁开0.5cm处另皮下浅刺一针作辅助电极,后连接HANS LH202H电针治疗仪,连续波,频率2 Hz,强度1m A,以大鼠肢体有震颤感为适宜强度,通电10min。每日治疗1次,共21天。大鼠于第22天行超声心动图机检测大鼠左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室射血分数(EF)和左室短轴缩短率(FS);TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡指数(AI);ELISA法检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、血管内皮细胞粘附分子1(VCAM-1)、内皮素1(ET-1);实时荧光定量PCR法检测大鼠心肌组织miRNA-133-3p、miRNA-133-5p、miRNA-1-3p、miRNA-486表达及靶基因Nol3、Caspase-3、Aifm2、Api5、RGD1564319、Aatk的表达。后对数据进行统计分析,并对miRNA与其靶基因进行相关性验证。2.SPF级雄性Wistar大鼠12只,每组3只,分组、治疗、取材方法同上。用微列阵基因芯片技术检测各组大鼠心肌miRNA表达谱状况。3.SPF级雄性Wistar大鼠70只,随机分为正常组、模型组、内关组、标配组、miRNA-133a-5p抑制剂组(抑制剂组)、miRNA-133a-5p激动剂组(激动剂组)、miRNA-133a-5p抑制剂+“标本配穴”电针组(抑制剂+标配组),每组10只。模型组、内关组、标配组、抑制剂组、激动剂组及抑制剂+标配组造模方法与上(方法1)相同。抑制剂组、抑制剂+标配组腹部皮下按10mg/kg于实验第1、7、14天进行miRNA-133a-5p抑制(antagomir)剂注射,共3次;激动剂组注射miRNA-133a-5p激动(agomir)剂,剂量、方法同抑制剂组相同。正常组方法与上(方法1)相同。正常组、模型组、抑制剂组、激动剂组大鼠只抓取固定,不针刺治疗。内关组、标配组、抑制剂+标配组进行电针治疗,抑制剂+标配组与标配组治疗方法相同,电针治疗方法与上(方法1)相同。实验第22天心脏取材,用实时荧光定量PCR法检测各组大鼠心肌组织miRNA-133-5p及其靶基因Caspase-3、Aifm2的表达;Western blot法检测各组靶基因Caspase-3、Aifm2的表达,并对数据进行统计及相关性分析。结果1.模型组大鼠心脏LVEDd、LVESD高于正常组(均为P<0.01),而EF、FS值均低于正常组(均为P<0.01);内关组、标配组LVEDd、LVESD均低于模型组(均为P<0.01),标配组低于内关组(分别为P<0.01,P<0.05);内关组、标配组中EF、FS值均高于模型组(均为P<0.01),标配组高于内关组(P<0.05)。2.正常组大鼠心肌AI值低于模型组(P<0.01);内关组、标配组均低于模型组(均为P<0.01);标配组低于内关组(P<0.05)。3.模型组大鼠血清CK-MB、VCAM-1、ET-1值均高于正常组(均为P<0.01);内关组、标配组均低于模型组(均为P<0.01);标配组均低于内关组(均为P<0.05)。4.运用微陈列芯片技术共筛选出758个miRNA基因信号,有20个具有差异化意义的miRNA基因信息:12个表达上调,8个表达下调;其中miR-133a-5p和miR-133a-3p上调趋势、miR-1-3p和miR-486下调趋势明显优于其它miRNA基因。通过Target Scan、miRanda和Pic Tar3种生物信息数据库交叉对上述4个miRNA基因与凋亡相关的靶基因进行预测:miR-133a-3p的靶基因为Nol3,miR-133a-3p的靶基因为Caspase-3和Aifm2,miR-1-3p的靶基因为Api5,miR-486的靶基因为RGD1564319和Aatk。5.(1)模型组大鼠心肌miRNA-133-3p、miRNA-133-5p表达均低于正常组(均为P<0.01),miRNA-1-3p、miRNA-486表达均高于正常组(均为P<0.01);内关组、标配组miRNA-133-3p、miRNA-133-5p表达均高于模型组(分别为P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.01),标配组均高于内关组(分别为P<0.05,P<0.01);内关组、标配组miRNA-1-3p、miRNA-486表达均低于模型组(分别为P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01),标配组均低于内关组(均为P<0.05)。(2)模型组心肌Nol3表达高于正常组(P<0.01),模型组与内关组、标配组没有显著差异(均为P>0.05);模型组Caspase-3、Aifm2表达均高于正常组(均为P<0.01),内关组、标配组均低于模型组(均为P<0.01),标配组均低于内关组(均为P<0.01);模型组Api5表达低于正常组(P<0.01),内关组与模型组无显著差异(P>0.05),标配组低于模型组(P<0.05);正常组RGD1564319表达与模型组无显著差异(P>0.05);模型组Aatk表达高于正常组(P<0.01),内关组与模型组无显著差异(P>0.05),标配组高于模型组(P<0.05)。(3)整体组间相关性及相关系数强度分析:miRNA-133a-3p与Nol3、miRNA-1-3p与Api5为中度负相关;miRNA-486与Aatk为中度正相关;miRNA-486与RGD1564319为轻度负相关;miRNA-133a-5p与Caspase-3、Aifm2均为高度负相关。6.(1)模型组大鼠心肌miRNA-133a-5p表达低于正常组(P<0.01);内关组、标配组、激动剂组、抑制剂+标配组均高于模型组(均为P<0.01),抑制剂组低于模型组(P<0.01);标配组、激动剂组、抑制剂+标配组均高于内关组(分别为P<0.01,P<0.01,P<0.05),抑制剂组低于内关组(P<0.01);激动剂组高于标配组(P<0.01),抑制剂组低于标配组(P<0.01),抑制剂+标配组与标配组无显著差异(P>0.05)。(2)模型组大鼠心肌Caspase-3、Aifm2表达(q RT-PCR检测)均高于正常组(均为P<0.01);内关组、标配组、激动剂组、抑制剂+标配组均低于于模型组(均为P<0.01),抑制剂组高于模型组(分别为P<0.01,P<0.05);标配组、激动剂组均低于于内关组(均为P<0.01),抑制剂组高于内关组(均为P<0.01),抑制剂+标配组与内关组无显著差异(P>0.05);抑制剂组高于标配组(均为P<0.01),激动剂组、抑制剂+标配组与标配组无显著差异(均为P>0.05)。(3)模型组大鼠心肌Caspase-3、Aifm2表达(Western-blot检测)均高于正常组(均为P<0.01);内关组、标配组、激动剂组、抑制剂+标配组均低于于模型组(均为P<0.01),抑制剂组高于模型组(均为P<0.05);标配组、激动剂组均低于内关组(均为P<0.01),抑制剂组高于内关组(均为P<0.01),抑制剂+标配组(Caspase-3)与内关组无显著差异(P>0.05),抑制剂+标配组(Aifm2)低于内关组(P<0.01);抑制剂组高于标配组(均为P<0.01),激动剂组、抑制剂+标配组与标配组无显著差异(均为P>0.05)。(4)整体组间相关性及相关系数强度分析:miRNA-133a-5p分别与Caspase-3、Aifm2(q RT-PCR、Western-blot检测)均为较强负相关。结论1.电针能够通过降低心肌缺血模型大鼠的LVEDd、LVESD值、提升EF、FS值,有效改善心肌缺血细胞凋亡导致的代偿性心脏扩张、心功能低下,降低心肌细胞凋亡程度,且“标本配穴”电针法比单纯内关电针法具有更好的效应。2.对于心肌缺血细胞凋亡后引发的心肌酶等指标改变,“标本配穴”电针和内关电针法均能通过有效减少实验大鼠血清CK-MB、VCAM-1及ET-1的活性表达发挥抗心肌缺血作用的,且“标本配穴”电针法比单纯内关电针法具有更好的效应。3.多miRNA基因参与了异丙肾上腺所致的大鼠心肌缺血细胞凋亡过程,心肌缺血过程中,主要表现在miRNA-133-3p、miRNA-133-5p表达下降,miRNA-1-3p、miRNA-486上升;“标本配穴”电针法能够通过有效地提升miRNA-133-3p、miRNA-133-5p的表达,降低miRNA-1-3p、miRNA-486的表达,其保护作用是通过调控这4个miRNA基因的方式抑制心肌细胞凋亡。4.miRNA基因及其靶基因是影响心肌缺血细胞凋亡的主要途径;“标本配穴”电针防治心肌缺血的miRNA基因信号调控通路中,miRNA-133-5p与Caspase-3、Aifm2之间的基因调控信号是主要途径。5.Caspase-3和Aifm2因子是激活细胞凋亡通道的主要执行因子,”标本配穴”电针抑制细胞凋亡、保护心肌缺血的作用主要是通过提升miRNA-133-5p的表达,进而减少Caspase-3、Aifm2的表达的双通道调控途径实现的。