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研究目的慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）是当前亟待解决的公共卫生问题之一,治疗肾间质纤维化是CKD的核心策略。中医药防治CKD疗效确切,但中药多成分多靶点是中药作用机制研究的难点,目前对中药药效物质及其作用机制的研究大多基于单一靶点的分子生物学或药理学研究,无法系统的阐明中药的整体药效作用及机制。近年来“组学”的出现为研究中药多组分药效物质的作用机制提供了一种全新且有效的方法。脂质组学是代谢组学中的一个重要分支,主要对生物体内脂质代谢进行系统分析,对不同生理状态下脂质代谢网络的变化进行比较,识别代谢调控中关键的脂质生物标志物,揭示脂质在各种生命活动中的作用机制。脂质组学技术有助于中药如何通过多组分、多靶点、多效应实现整体作用进行系统的分析与阐述,为中药药效物质的作用机制研究提供有力的技术支撑,也为整个中医药理论的发展提供了一种系统的科学方法。为了更全面系统的揭示大黄在治疗CKD方面的作用机制,本研究基于脂质组学技术对其进行研究和验证。以大黄为核心的方剂在CKD治疗中应用广泛。然而,迄今为止,采用组学技术结合分子生物学技术阐明大黄抗肾纤维化作用及机制的研究较少。本课题拟结合分子生物学及脂质组学等方法开展整体、细胞和分子多层次研究,探索大黄及其组分抗肾纤维化的肾保护作用,为临床应用提供科学的理论依据和实验支撑,为阐释中医药治疗CKD的作用机理提供新的思路和方法。研究方法本课题中以小鼠单侧输尿管梗阻模型（Unilateral ureteral obstruction,UUO）、TGF-β1诱导的HK-2细胞为研究模型,首先对大黄提取物（Rhubarb,RH）进行体内药效学评价;然后对大黄组分芦荟大黄素（Aloe-emodin,AE）和大黄素（Emodin,EM）进行体内药效学评价,并与阳性对照药氯沙坦（Losartan,LST）进行药效对比,进一步验证大黄肾保护作用;其次,通过血清脂质组学研究,对内源性脂质代谢物进行筛选,寻找差异性代谢物,分析药物作用网络图并阐释药物作用机制;最后,对代谢网络图筛选到的作用通路,芦荟大黄素和大黄素进行相关通路验证。实验内容主要分为以下四个部分:1.大黄提取物肾保护作用药效学评价体内研究:实验C57BL/6雄性小鼠（n=24）按照随机数字表分配进行以下实验,Sham组（n=8）、UUO组（n=8）、UUO+RH组（n=8）。行UUO手术,自手术日起给予大黄提取物,给药剂量相当于3 g·kg-1大黄的生药量,每日灌胃1次,连续给药两周。两周后观察给药后小鼠血肌酐,尿素氮等指标的变化,观察肾损伤病理形态的改变。2.大黄组分肾保护作用研究体内研究:实验C57BL/6雄性小鼠按照随机数字表分配进行以下实验,Sham组（n=8）、UUO组（n=8）、UUO+LST（n=8）和UUO+AE/EM组（n=8）,行UUO手术,术后当天起给予LST(给药剂量为10 mg·kg-1)和AE/EM(给药剂量均为20 mg·kg-1),每日灌胃1次,连续给药两周。治疗结束后,对小鼠血肌酐,尿素氮等指标进行检测,评价生理生化指标。通过病理HE、PAS和Masson染色,观察小鼠肾组织病理形态变化。大黄组分芦荟大黄素和大黄素抗肾纤维化作用评价:采用免疫组化技术观察纤维化相关分子TGF-β1、α-SMA、Collagen I和Fibronectin在肾组织中的变化;通过Western blot和Real-time PCR（RT-PCR）方法来检测TGF-β1、α-SMA、Collagen I、Collagen IV、E-cadherin和Fibronectin等纤维化相关分子的表达,对大黄组分体内抗肾纤维化作用进行评价。3.芦荟大黄素抗肾纤维化脂质组学分析实验C57BL/6雄性小鼠按照随机数字表分配进行以下实验,Sham组（n=8）、UUO组（n=8）和UUO+AE组（n=8）,行UUO手术,术后当天起给予AE(给药剂量为20 mg·kg-1),每日灌胃1次,连续给药两周。基于超高效液相色谱（UPLC-Q Exactive-MS）技术,运用脂质组学分析方法,对Sham组、UUO组和UUO+AE组血清中的脂质代谢物进行检测。数据经过预处理后,采用多元统计分析方法、主成分分析、偏最小二乘法判别分析和正交偏最小二乘判别分析。并结合Lipidmaps、HMDB和Metaboanalysis 4.0等相关数据库确定脂质差异代谢物,筛选和鉴定与CKD相关的生物标志物。将筛选的差异代谢物,通过KEGG数据库,对差异代谢物进行代谢通路富集分析,比较各组间脂质差异代谢物参与的信号转导通路和生化代谢通路,寻找与疾病和药物治疗相关的作用通路。4.大黄组分抗肾纤维化作用机制研究体内研究:实验C57BL/6雄性小鼠按照随机数字表分配进行以下实验,Sham组（n=8）、UUO组（n=8）、UUO+LST（n=8）和UUO+AE/EM组（n=8）,行UUO手术,术后当天起给予氯沙坦LST(给药剂量为10 mg·kg-1)和AE/EM(给药剂量均为20 mg·kg-1),每日灌胃1次,连续给药两周。治疗结束后,通过透射电镜观察肾组织自噬体和脂滴变化;通过Western blot和RT-PCR检测自噬标志性分子LC3、LC3 II/LC3 I和Beclin-1表达水平变化;通过Western blot和RT-PCR检测自噬经典通路PI3K/Akt/mTOR,相关分子PI3K、p-Akt和mTOR的表达情况。体外研究:选用TGF-β1诱导的HK-2细胞模型模拟体外肾损伤的过程,实验分为control组、TGF-β1组和TGF-β1+AE/EM（给药剂量均为40μM）组。为了观察给药后细胞凋亡情况,采用流式细胞术进行观察;为了考察纤维化和自噬相关分子的表达情况,采用免疫荧光、Western blot和RT-PCR法进行考察。研究结果1.大黄提取物具有肾损伤保护作用体内研究结果表明:大黄提取物给药组小鼠血肌酐由UUO组的126.4±11.34μmol·L-1降低到72.03±7.208μmol·L-1（p<0.05）,尿素氮由UUO组的21.98±2.891μmol·L-1降低到16.91±1.538μmol·L-1（p<0.05）,给药组小鼠肾组织偶见上皮细胞脱落、少量间质炎细胞浸润和小灶状肾纤维化。大黄提取物具有抗肾纤维化肾保护作用。2.大黄组分芦荟大黄素和大黄素抗肾纤维化肾保护作用研究体内研究结果表明:芦荟大黄素和大黄素给药组小鼠血肌酐分别由UUO组的119.4±12.76μmol·L-1、122.5±13.50μmol·L-1降低到83.38±5.012μmol·L-1、81.63±4.749μmol·L-1（p<0.05）,尿素氮分别由UUO组的20.74±3.691μmol·L-1、20.74±3.691μmol·L-1降低到15.15±0.977μmol·L-1、15.15±0.977μmol·L-1（p<0.05）,肾小管损伤指数评分分别由UUO组的11.6±1.00、11.7±1.00降低到9.44±0.88、9.67±0.71（p<0.05）,给药组小鼠肾组织偶见上皮细胞脱落、少量间质炎细胞浸润和小灶状肾纤维化。Western blot和RT-PCR结果表明芦荟大黄素和大黄素可以调控肾纤维化分子的表达。芦荟大黄素和大黄素具有抗肾纤维化作用,能够显著降低血肌酐和尿素氮等生理生化指标、减轻肾损伤和肾纤维化程度、降低肾小管损伤和肾纤维化评分,芦荟大黄素和大黄素给药后调控抗肾纤维化分子表达。体外研究结果表明:TGF-β1造模后HK-2细胞呈梭形、间隙加大、生长缓慢,芦荟大黄素和大黄素给药后可以减少细胞梭状形态、加快细胞生长。芦荟大黄素可显著降低细胞死亡率,细胞死亡率由12.78%±0.84%减少到8.88%±0.67%（p<0.05）。芦荟大黄素和大黄素可以调控细胞抗肾纤维化相关分子的表达（p<0.05）。通过浓度筛选,芦荟大黄素和大黄素的最佳给药浓度均为40μM。体内和体外实验结果提示芦荟大黄素和大黄素具有抗肾纤维化作用。3.芦荟大黄素抗肾纤维化肾脂质组学分析脂质组学研究结果显示:芦荟大黄素可改变小鼠内源性脂质代谢物的变化趋势,给药后脂质代谢物的变化趋势更接近于假手术组,远离UUO模型组。从正负离子660个代谢物中鉴定和筛选到20个潜在的生物标志物（p<0.05）。通路分析发现这20个生物标志物主要参与了自噬调控、甘油磷脂代谢、代谢途径、脂肪细胞脂解作用的调节和糖基磷脂酰肌醇锚生物合成等通路的代谢。代谢网络图分析发现,自噬通路是芦荟大黄素抗肾纤维化的关键通路。4.大黄组分抗肾纤维化作用机制研究体内研究结果表明:芦荟大黄素和大黄素具有激活体内自噬的作用,电镜结果显示芦荟大黄素和大黄素可以增加小鼠肾组织自噬体和脂滴;Western blot和RT-PCR结果显示,与UUO组相比,芦荟大黄素和大黄素可显著上调自噬标志性分子LC3、LC3 II/LC3 I和Beclin-1的表达（p<0.05）;下调PI3K、p-Akt和mTOR的表达（p<0.05）。体外研究结果表明:芦荟大黄素和大黄素具有激活细胞自噬的作用,免疫荧光、Western blot和RT-PCR结果显示,治疗药物可显著上调自噬标志性分子LC3、LC3 II/LC3 I和Beclin-1的表达（p<0.05）;下调PI3K、p-Akt和mTOR的表达（p<0.05）。研究结论1.本课题对中药大黄及其组分芦荟大黄素和大黄素进行了体内和体外药效作用研究,证实了大黄及其组分芦荟大黄素和大黄素在整体水平可以降低生化指标;在动物器官水平上发挥抗肾纤维化作用,具有恢复肾功能的作用;在细胞水平上能够抗纤维化,继而发挥肾损伤保护作用。2.基于UPLC-Q Exactive-MS技术,研究UUO小鼠模型脂质代谢状态及芦荟大黄素对UUO小鼠脂质代谢紊乱的干预程度。通过对20个脂质生物标志物进行相关通路分析,自噬调控是大黄组分抗纤维化的关键作用途径。揭示大黄组分具有抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路及调控机体脂质生物标志物的作用。分子生物学实验结果与脂质组学分析结果相吻合。通过本课题的研究,对大黄及其组分抗肾纤维化保护肾损伤的整体药效和作用机制有了更深入的认识。研究结果不仅拓展了大黄及其组分防治CKD的治疗思路,更为研究中药药效物质抗肾纤维化作用提供理论和实验依据。