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细胞是生物体结构和功能的基本单位。利用活细胞作为研究对象，在单个分子水平上研究生命的基本过程，了解生命现象的本质，具有非常重要的意义。近年来，单分子荧光技术的发展为我们探索生命奥秘，深入了解生物大分子工作机制提供了新的手段。
全内反射荧光成像技术作为单分子荧光技术的一种，可以原位实时动态观察活细胞膜上的单分子行为，因此已经成为了研究细胞膜区的生命过程的重要工具。目前活细胞单分子全内反射荧光成像技术主要用于单个膜蛋白分子如各种膜蛋白受体的研究。本论文工作以TGF-β信号转导通路重要蛋白为研究对象，拓展单分子全内反射荧光成像技术，用于活细胞体系细胞内信号转导下游蛋白的研究，以及信号通路抑制剂作用机制的研究。
转化生长因子TGF-β信号转导体系是一类至关重要的细胞信号转导体系。它参与调控细胞增殖、分化、迁移和凋亡，调节生物体内各器官组织的发育、修复和内平衡，肿瘤发生发展和转移。因此，深入了解该信号转导的机制，尤其是在活细胞上实时动态的研究其信号传递机制意义重大。
本论文利用全内反射荧光显微术，通过实时表征 TGF-β信号转导体系中细胞内下游蛋白Smad3和Smad7在细胞膜区域的动态行为，在单分子水平上研究了Smad3的激活和Smad7抑制TGF-β信号转导的机制。同时还在单分子水平上研究了天然产物柚皮素抑制 TGF-β信号转导的分子机制，具体内容如下：
1.研究了Smad3在细胞膜区域的激活模式。由于Smad3激活的瞬时性，通过传统生物学的方法很难了解其激活过程，因此对Smad3激活过程一直存在争议。通过对细胞膜区的GFP-Smad3进行活细胞单分子荧光成像，我们实时地观察到在TGF-β信号通路中单个Smad3分子上膜的动态行为。通过定量地表征Smad3在膜上的扩散速度和停留时间，我们提出了Smad3在细胞膜区域的一种激活模型：在无配体刺激的细胞中，Smad3可通过PI(3)P来介导上膜。当加入TGF-β1配体后，Smad3显示出较慢的扩散速率和较快的解离速率，这表明Smad3在细胞膜与激活的TGF-β受体结合而被激活。Smad3的激活并不依赖于受体的内吞。使用突变Smad3的实验结果表明Smad3的磷酸化可以加快它在细胞膜和细胞质中穿梭，从而传递 TGF-β0号。
2.研究了Smad7在细胞膜区与TβRI受体的结合。利用传统的生物学方法，如免疫共沉淀和免疫荧光的方法研究Smad7对 TGF-β信号的抑制作用，难以观测Smad7与TβRI受体结合的动态过程和调控机制。通过对细胞膜区的GFP-Smad7进行活细胞单分子荧光成像，我们实时地观察到在TGF-β信号通路中单个Smad7分子上膜的动态行为。我们发现无论有无TGF-β1刺激Smad7都会上膜并且与TβRI受体结合。但是在加入 TOF-β1前后，Smad7在膜上表现出两种不同的解离速率，这表明Smad7在细胞膜区域有两种不同的结合状态。同时我们还发现Smad泛素化调节因子1(Smurf1)和脂筏的存在能够促进Smad7与激活型TβRI结合的稳定性。研究了柚皮素对 TGF-β信号通路的干扰作用。由于小分子化合物抑制剂具有易合成、组织渗透性好和稳定性高等优点，发展 TGF-β信号通路的小分子抑制剂的具有重要意义。我们利用通过对TβRⅡ受体的单分子荧光成像，结合单分子力谱法，发现天然化合物柚皮素有一种不同于已有TGF-β信号通路小分子抑制的干预机制：柚皮素能够降低 TGF-β1与其特异性受体TβRⅡ的结合几率，因而抑制受体的二聚激活来抑制下游蛋白Smad3的磷酸化，从而抑制 TGF-β信号通路的传导。
总之，本论文工作发展了研究细胞信号转导的新方法，并为深入了解TGF-β信号转导通路的分子机制提供了新的依据。