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猪生长激素(porcine Growth Hormone,pGH)是由猪脑垂体前叶嗜酸性细胞合成190个氨基酸组成的单链多肽类激素激素,具有促进脂肪分解,骨骼生长,提高猪胴体的瘦肉率和胶原合成的功能,能极大改善生猪胴体质量,在生猪养殖业中具有重大的社会经济价值。本研究从猪脑垂体中提取总RNA,反转录扩增得到猪生长激素的c DNA序列,将其克隆到载体pPICZA、pPICZαA上,构建pPICZA-pGH、pPICZαA-pGH毕赤酵母表达载体,诱导表达后通过SDS-PAGE和Western-blot检测p GH蛋白的表达情况。结果显示:胞内表达pGH蛋白多为不可溶蛋白,而分泌表达pGH蛋白的表达量低,仅有78 mg/L。为了提高pGH表达水平,对猪生长激素pgh基因进行优化,将优化后的基因转化毕赤酵母X-33,构建胞内表达菌株,结果显示:pGH蛋白在毕赤酵母细胞内仍以不溶蛋白的形式存在,可溶的pGH蛋白很少。为了提高胞内可溶pGH蛋白的含量,构建定位于内质网的pGH表达载体pPICZA-pGH(优化)-HDEL与分子伴侣Bip和PDI共表达菌株X33-pGH(优化)-Bip-PDI,SDS-PAGE在共表达菌株胞内沉淀样品中检测到pGH蛋白减少,但是胞内可溶p GH蛋白含量仍然很低,说明分子伴侣Bip和PDI可能导致不溶性p GH蛋白降解,而不能改善pGH蛋白的可溶性。在pGH胞内表达菌株中过表达分子伴侣Ssa1和Sis1,通过SDS-PAGE和Western-blot检测细胞内pGH的表达水平,结果显示:过表达分子伴侣Ssa1和Sis1后,胞内可溶的pGH蛋白水平提高,可溶pGH蛋白为70 mg/L。说明分子伴侣蛋白Ssa1、Sis1可以改善pGH蛋白在毕赤酵母细胞内的可溶性。另外研究了毕赤酵母表达pGH蛋白的条件,在20℃和pH6.0条件下,诱导48小时蛋白表达水平最高,其表达量为340 mg/L。用pGH蛋白刺激猪小肠上皮细胞增殖,MTT法检测在48小时,125μg/L可溶p GH蛋白处理组相比对照组增殖率为249%,125μg/L变性纯化pGH蛋白处理组相比对照组增殖率为211%,说明可溶pGH蛋白和变性纯化pGH蛋白均具有促进猪小肠上皮细胞增殖作用。综上所述,密码子的优化对于pGH蛋白在毕赤酵母中的胞内表达是很有必要的,共表达分子伴侣Ssa1和Sis1,则可以改善p GH蛋白在毕赤酵母细胞内的可溶性,为后续研究毕赤酵母细胞内pGH蛋白的可溶性表达奠定基础。