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目的：
构建重组人白细胞介素-11(hrIL-11)工程菌，得到高纯度的hrIL-11蛋白，并研究其生物学活性。
方法：
1．pET21a-hrIL-11重组质粒的构建
应用PCR方法获取hrIL-11基因片段，将其插入到pET21a(+)载体中。转化感受态细胞，挑取单克隆菌落，提取质粒，酶切鉴定，送检测序。
2．hrIL-11蛋白的表达纯化
将测序正确的质粒转化感受态细胞，培养OD600为0.4-0.6时，用1mmol/LIPTG诱导4h。收集菌体，超声破菌后收集并洗涤包涵体，用8mol/L尿素溶解包涵体。镍金属螯合层析柱分离纯化重组蛋白。
3．hrIL-11蛋白的复性及Westernblotting鉴定
将蛋白浓度调整至50～100μg/mL，在大于20倍体积的如下透析液中4℃透析复性A(20mmol/LTris-HCL，3mol/L尿素，1mmol/LEDTA，pH8.0)，B(20mmol/LTris-HCL，1mol/L尿素，1mmol/LEDTA,pH8.0)，C(20mmol/LTris-HCL，1mmol/LEDTA，pH8.0)，每12h换液1次，最终换用磷酸盐缓冲液(1×PBS，pH7.4)透析12h，12，000r/min离心15min除去不溶物，收集上清，0.22um滤膜过滤除菌，-20℃保存。对复性蛋白进行Western-blotting鉴定。SDS-PAGE分离蛋白，利用半干电转仪将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭60min，加入1:500封闭液稀释的鼠抗人IL-11单克隆抗体孵育60min，洗膜后加入1：4000PBST稀释的酶标羊抗鼠二抗，DAB显色。
4.hrIL-11/His蛋白的生物学活性测定
含10％新生牛血清和2ng/mLhIL6的RPMI1640培养液培养IL-6依赖细胞株T1165，活性测定前用只含有10％新生牛血清的RPMI1640培养液洗涤3次，以除去原培养基中的hIL6。调整细胞浓度为1～2×105/mL，接种到96孔平底培养板，每孔加100μL，加入不同稀释度IL-11待检样品，100μL/孔，每份设3个重复孔。设含IL11标准品的阳性对照和不加IL-11的阴性对照。培养48～72h后，每孔加10μLMTT，继续培养4～6h，轻轻吸出150μL上清，加入150μL二甲亚砜(DMSO)，溶解10min后，570nM测定吸光度值。
结果：
1．重组质粒的构建
经PCR扩增的hrIL-11基因片段长度为510bp，与预计大小相符。经序列比对准确无误，无读码错误。
2．重组蛋白表达纯化
重组质粒pET21a-hrIL-11转化BL-21(DE3)感受态细菌，经IPTG诱导表达，目的蛋白占菌体总蛋白的20％，主要以包涵体的形式存在，分子量19KD。在Ni-NTA亲和层析中采用30～200mmol/L咪唑的梯度洗脱，最后hrIL-11蛋白的纯度达到95％以上。
3．重组蛋白Westernblotting鉴定
Westernb1ot结果证实，目的蛋白是带有6His标签的IL-11重组蛋白。
4．重组蛋白的生物学活性测定
利用T1165细胞体外增殖实验检测hrIL-11生物学活性，结果表明，纯化蛋白的比活达1×106IU/mg，与IL-11标准品相当。
结论：
1．成功构建了pET21a-hrIL-11高效表达质粒
2．成功制备了纯度大于95％的hrIL-11蛋白
3．获得了具有IL-11生物学活性的hrIL-11蛋白