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目的1.培养来源于人的泪腺腺样囊性癌肿瘤细胞系,为肿瘤干细胞样细胞提取做准备。2.分离培养出来源于人的泪腺腺样囊性癌肿瘤干细胞样细胞。3.研究人泪腺腺样囊性癌的肿瘤干细胞样细胞并对其干细胞相关特性进行鉴定。方法1.实验第一部分:肿瘤干细胞样细胞的分离及其培养。常规含血清培养基培养人泪腺腺样囊性癌肿瘤细胞系(Human Lacrimal Adenoid Cystic Carcinoma,LACC)细胞,根据其自身生长规律,选用生长状态最佳的代数,采用无血清悬浮培养法,即胰蛋白酶消化贴壁生长的细胞,制备成单细胞混悬液,以一定细胞密度接种于无血清培养基(serum free medium,SFM)中悬浮培养生长,定期更换培养基,从而收集获得人泪腺腺样囊性癌肿瘤干细胞样细胞LACC-CSCs(Cancer Stem Cell,CSC),传代或进行下一步鉴定。2.实验第二部分:肿瘤干细胞样细胞相关特性鉴定。收集采用无血清悬浮法培养获得的生长稳定的肿瘤干细胞微球体,应用倒置相差显微镜观察人泪腺腺样囊性癌肿瘤细胞及肿瘤干细胞样细胞形态学差异,流式细胞术分别检测两种类型细胞干细胞相关表面分子标志CD133,ABCG2的表达情况,应用Transwell体外侵袭实验检测两种类型细胞不同时间段细胞的侵袭能力差异,应用胎牛血清诱导液及内皮细胞诱导液诱导肿瘤干细胞样细胞分化,检测其定向分化潜能,体外裸鼠移植瘤实验检测两种类型细胞致瘤力差别。结果1.LACC细胞接种在含血清培养基中培养,细胞呈贴壁生长,形成铺路石样结构,接种在无血清培养基后,细胞逐渐漂浮并聚集成球生长,随培养时间推移,细胞微球体逐渐增大,折光性较强,细胞间连接紧密,10~12天可形成形态规则的肿瘤微球体,略呈串珠状或葡萄状。通过连续传代培养,可保持良好的克隆成球能力。2.经初步鉴定发现肿瘤细胞球体具有干细胞相关特征:1)倒置相差显微镜观察普通肿瘤细胞在含胎牛血清培养基中呈现贴壁扁平生长的状态,类似铺路石结构,应用无血清悬浮培养液培养的肿瘤干细胞样细胞呈葡萄球串珠状生长,细胞微球体逐渐增大,形态上完全不同于普通肿瘤细胞。2)流式细胞仪检测示LACC-CSCs表达CD133比率为(35.67±6.86)%,LACC为(0.46±0.48)%,二者比较差异具有统计学意义(t=-8.867,P<0.05);LACC-CSCs表达ABCG2为(39.99±4.54)%,LACC为(6.75±1.34)%,二者比较差异具有统计学意义(t=-9.932,P<0.05)。同普通LACC细胞相比,LACC肿瘤干细胞样细胞表达干细胞相关表面分子标志,与LACC存在明显差异。3)Transwell体外侵袭实验示,培养24小时后,LACC-CSCs穿过Matrigel基底膜平均为(32.60±8.79)个/HP,LACC为(10.20±2.77)个/HP,两组比较差异有统计学意义(t=5.433,P<0.05);培养48小时后LACC-CSCs穿过Matrigel基底膜平均为(62.60±4.83)个/HP,LACC为(44±5.34)个/HP,两组比较差异有统计学意义(t=5.779,P<0.05)。LACC肿瘤干细胞样细胞同普通LACC细胞相比具有更强的组织迁移侵袭能力,可能造成更严重的组织破坏。4)应用血清诱导肿瘤干细胞球可见其逐渐贴壁生长,移形为贴壁的多边形肿瘤细胞,同普通肿瘤细胞无异,成铺路石样形态。应用含血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)等的血清培养基低氧诱导,LACC-CSCs呈贴壁生长,细胞形态改变,连续诱导后三维基质胶中可形成血管腔样结构,表达血管内皮标记CD31、CD34。说明LACC-CSCs在特定培养条件下具有定向分化能力。5)体外移植瘤实验显示,两种细胞接种后均在观察时间内成瘤,成瘤率100%,相比于普通LACC细胞,肿瘤干细胞样细胞成瘤时间短,成瘤体积大,具有更强的致瘤力。结论1.通过无血清悬浮培养法可获得人泪腺腺样囊性癌肿瘤干细胞样细胞,通过改进培养条件和体系有望富集更多的肿瘤干细胞。2.富集到的肿瘤干细胞样细胞表现出类似干细胞的特征,有较强的增殖能力,表达干细胞相关标志,较强的组织侵袭力、致瘤力,具有定向分化的潜能,为后续深入研究肿瘤干细胞及其靶向干细胞的治疗方案提供实验基础。