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人硫酸酯酶1（human sulfatase1, hSulf-1）基因定位于人8号染色体长臂8q13.39，编码一种芳香硫酸酯酶，在某些肿瘤细胞系可明显抑制肿瘤生长迁移及增强一些抗癌药物诱导的凋亡作用，因此被认为是肿瘤抑制因子。硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPGs）是细胞外基质的重要组成部分，能够直接介导肝素结合的细胞生长因子配体和特异受体（HB-GFR）之间的相互作用。hSulf-1能够使HSPGs脱硫酸化，抑制HSPGs介导的信号通路的活性，进而抑制细胞的增殖、侵袭、迁移、血管增生及转移灶的形成。除此之外，它还与细胞的粘附性、细胞骨架修复、凝血功能、以及转化生长因子β（TGF-β1）、Wnt/β-catenin、AKT/ERK和细胞上皮间质转化的信号通路的活性高度相关。本研究旨在构建含有目的基因hSulf-1的多种类型腺病毒表达载体（包括非增殖型腺病毒Ad5-hSulf1、溶瘤腺病毒AdSurp-hSulf1和放射诱导增强型溶瘤腺病毒Ad.eSurp-hSulf1），研究hSulf-1对肝癌细胞周期以及对乳腺癌化疗敏感性的影响，探讨hSulf-1抗肿瘤效应及其分子机制。我们的研究为将来进行肿瘤靶向治疗奠定了基础。第一部分腺病毒载体构建及鉴定【目的】克隆hSulf-1基因并构建稳定表达的非增殖型腺病毒载体Ad5-hSulf1、肿瘤特异增殖型溶瘤腺病毒载体AdSurp-hSulf1、放射诱导增强型溶瘤腺病毒载体Ad.eSurp-hSulf1及其相应的携带绿色荧光报告基因（EGFP）的阴性对照病毒Ad5-EGFP、AdSurp-EGFP、Ad.eSurp-EGFP。【方法】以质粒pcDNA3.1-hSulf1为模板，设计含有BamHI和SalI酶切位点的hSulf-1基因上下游引物，采用PCR的方法扩增出含有hSulf-1基因的完整序列，将pDC315及hSulf-1基因酶切回收的产物连接，得到pDC315-hSulf1；以hSulf-1基因酶切回收产物置换pAdSurp-P53中的P53序列，获得pAdSurp-hSulf1；在pAdSurp-hSulf1启动子Surp上游插入Egr-l基因CArG调控元件作为增强子构建pAd.eSurp-hSulf1。以EGFP基因置换pDC315-hSulf1、pAdSurp-hSulf1、pAd.eSurp-hSulf1中的hSulf1，构建pDC315-EGFP、 pAdSurp-EGFP、pAd.eSurp-EGFP。鉴定正确后，用Lipofectamine2000转染试剂，将pDC315-hSulf1、pAdSurp-hSulf1、pAd.eSurp-hSulf1分别与腺病毒包装质粒pBHGloxdelEl3cre共转染HEK293细胞中，包装产生非增殖型腺病毒载体Ad5-hSulf1、溶瘤腺病毒AdSurp-hSulf1、放射诱导增强型溶瘤腺病毒Ad.eSurp-hSulf1。同样方法获得表达EGFP的阴性对照病毒。【结果】成功构建了非增殖型腺病毒载体Ad5-hSulf1、溶瘤腺病毒载体AdSurp-hSulf1、放射诱导增强型溶瘤腺病毒载体Ad.eSurp-hSulf1及其对应的阴性对照病毒，并且能够在真核细胞中表达目的基因。【结论】表达hSulf-1的腺病毒载体构建成功，为下一步研究基因的功能、探讨目的基因对肿瘤细胞周期以及对化疗药物敏感性的影响奠定了基础。第二部分腺病毒介导hSulf-1表达对肿瘤细胞周期的影响【目的】研究腺病毒介导的hSulf-1基因感染肝癌和乳腺癌细胞系后，细胞周期分布的变化。【方法】采用蛋白质免疫印迹法检测hSulf-1基因在肝癌细胞系和乳腺癌细胞系中的表达情况，用流式细胞术检测肿瘤细胞过表达hSulf-1基因后细胞周期分布变化。【结果】蛋白质免疫印迹检测hSulf-1在肝癌细胞系SMMC-7721、MHCC-97L及乳腺癌细胞系MCF-7中低表达，流式细胞术检测结果显示：hSulf-1低表达肿瘤细胞感染Ad5-hSulf1后细胞周期出现G2/M期阻滞。【结论】hSulf-1基因的过表达可引起肿瘤细胞周期分布变化。第三部分腺病毒介导hSulf-1表达拮抗bFGF引起的肝癌细胞周期变化及抗肿瘤效应【目的】研究hSulf-1拮抗bFGF引起的肝癌细胞周期变化及其抗肿瘤效应。【方法】以bFGF诱导刺激肝癌细胞SMMC-7721和肝正常细胞WRL-68，然后感染Ad5-hSulf1；流式细胞术检测细胞周期变化，蛋白免疫印迹检测细胞周期相关蛋白CDK4、E2F的变化，MTT、Transwell、划痕实验分别检测细胞增殖、侵袭和迁移能力变化。【结果】流式细胞术实验结果表明，hSulf-1基因能够拮抗bFGF刺激引起的细胞周期演进，诱导细胞周期阻滞。蛋白免疫印迹实验结果表明bFGF刺激后的SMMC-7721细胞周期相关蛋白CDK4、E2F上调，而hSulf-1可明显拮抗bFGF的作用，下调这两种蛋白的表达。MTT实验结果表明，hSulf-1基因可拮抗bFGF引起的细胞增殖。Transwell和划痕实验结果表明，hSulf-1可拮抗bFGF的作用，抑制SMMC-7721细胞的侵袭和转移。【结论】 hSulf-1拮抗bFGF刺激引起的肝癌细胞周期变化并且能抑制细胞的增殖、侵袭和迁移能力。第四部分腺病毒介导hSulf-1表达提高乳腺癌细胞MCF-7对AZD2281敏感性的研究【目的】探讨人硫酸酯酶-1（human sulfatase1，hSulf-1）基因重组腺病毒Ad5-hSulf1对乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移及其化疗敏感性的影响。【方法】将重组腺病毒Ad5-hSulf1感染MCF-7细胞，采用不同浓度AZD2281处理细胞，并筛选AZD2281处理的最佳浓度用于后续实验，采用流式细胞术检测细胞周期，用软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成率，蛋白免疫印迹检测细胞周期蛋白CDK4及p-AKT的表达，Transwell法、MTT法分别检测细胞迁移及增殖能力。【结果】AZD2281浓度为7μmol/L时对MCF-7细胞的抑制作用趋于峰值，用于后续实验。Ad5-hSulf1+AZD2281组与AZD2281组相比，G2/M期细胞比例明显增多，细胞克隆形成率及细胞周期蛋白CDK4的表达、AKT的磷酸化水平均明显下调，同时细胞增殖率、迁移率也有明显下降。【结论】 hSulf-1过表达可明显提高乳腺癌细胞MCF-7对AZD2281的敏感性，阻滞细胞周期于G2/M期，并抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移能力，从而为乳腺癌的药物治疗提供新的临床参考依据。