论文部分内容阅读
食管癌是人类最常见的恶性肿瘤之一。目前食管癌在全世界的发病率占所有恶性肿瘤的第八位，因食管癌导致的死亡人数占所有肿瘤死亡患者的5.7％。我国是食管癌的高发区，世界上70％的食管癌发生在我国，由于诊断较晚治疗效果较差，食管癌的五年生存率仅10％左右，在我国的恶性肿瘤死亡率中居第四位。在食管癌化疗中，抑制微管蛋白聚合和微管解聚从而引起细胞凋亡的药物是非常重要的一类，紫杉醇是这类药物中常用的药物。研究表明，细胞周期素CyclinB1和微管损伤诱导的细胞凋亡有重要联系。
CyclinB1是调控细胞由G2期向M期转换的重要因子之一。G2期末CyclinB1的表达达到高峰，激活CDC2，形成CyclinB1/CDC2复合物，进入细胞核，裂解一系列底物蛋白，推动细胞从DNA合成期进入有丝分裂期。
本实验室采用免疫组织化学的方法分别比较205例配对食管癌癌组织和癌旁组织的CyclinB1蛋白表达水平的差异，发现在食管癌细胞中存在CyclinB1高表达的现象。挑选了CyclinB1低表达的KYSE150细胞株采用转染的方法，外源导入pCDNA3.1CyclinB1质粒，构建CyclinB1高表达的稳定细胞株。实验结果表明CyclinB1高表达能增强细胞的增殖能力、致瘤性以及穿透能力，抑制顺铂诱导的食管癌细胞凋亡。
为了深入研究CyclinB1蛋白表达水平对食管癌细胞的影响，我们用Westernblot的方法挑选了CyclinB1高表达的EC9706细胞株采用转染的方法，外源导入pGCsi-U6/Neo/GFP/shCyclinB1，挑选单克隆，用Westernblot方法检测CyclinB1蛋白表达的差异，用RT-PCR方法检测CyclinB1mRNA水平，扩增后构建稳定低表达CyclinB1的细胞株，同时建立转染pGCsi-U6/Neo/GFP-Non的细胞株作为空载对照。绘制各细胞株的生长曲线比较其增殖能力。克隆形成和Transwell实验分别比较各细胞株的致瘤性和体外侵袭能力。给予一定浓度紫杉醇处理各细胞株，比较其生存率；采用细胞免疫荧光的方法观察细胞核形态的变化；测定各细胞株PARP蛋白剪切水平，综合实验结果比较各细胞株在紫杉醇处理后的凋亡水平。
实验结果显示，两个CyclinB1低表达细胞株与EC9706、空载细胞株相比：细胞生长速度减慢、增殖能力下降；致瘤性和体外侵袭能力降低。紫杉醇处理后生存率降低，细胞核形态发生凋亡变化的细胞比例升高。由此可以得出结论，CyclinB1的低表达会抑制食管癌细胞的增殖，降低食管癌细胞的致瘤性及侵袭能力，增强化疗药物诱导的食管癌细胞凋亡，使其对化疗药敏感性增高。
检测紫杉醇作用后各细胞株CyclinB1蛋白的表达情况，发现EC9706、空载细胞株与两个低表达细胞株的CyclinB1蛋白表达量均与药物处理前相比有显著提高，说明药物可以诱导或促进食管癌细胞CyclinB1蛋白的表达。文献报道，细胞表达的CyclinB1蛋白和受药物诱导而表达的CyclinB1蛋白在细胞定位以及出核入核机制上存在不同。非药物诱导的CyclinB1蛋白主要位于细胞质，而药物诱导表达的CyclinB1蛋白主要集中在细胞核。CyclinB1蛋白低表达增强细胞凋亡的可能机制是，正常表达的CyclinB1蛋白存在于细胞质中，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡；药物诱导的CyclinB1蛋白存在于细胞核中，促进细胞凋亡。其中的确切过程和机制还有待进一步研究。
CyclinB1蛋白的表达水平和食管癌细胞的增殖速度密切相关，CyclinB1的过表达可导致肿瘤细胞的恶性度增加、增强肿瘤细胞的转移能力。其表达水平可望作为判断食管癌患者临床预后的一个指标。降低CyclinB1蛋白的表达水平、抑制CyclinB1/CDC2复合物入核，可能将有助于提高肿瘤化疗的疗效。因此CyclinB1极有可能成为肿瘤药物治疗的新靶点。