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人腺病毒（humanadenoviruses,HAdVs）属于腺病毒科（Adenoviridae）的哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）,常引起群体暴发感染及流行,是社区获得性肺炎（community acquired pneumonia,CAP）常见病原体之一,有广泛的组织嗜性,可感染呼吸道、眼、胃肠道和泌尿生殖道的粘膜上皮细胞,分为A-G种（species）或组（subgroup）,近年来HAdVs在同组间可发生基因重组,导致新基因型出现,目前至少有103种型别。该病毒为双链DNA病毒,26-45kb大小的基因组编码40多种蛋白,其中3种为重要的结构蛋白,即五邻体基座蛋白（Pentonbase）,六邻体蛋白（Hexon）和纤维蛋白（Fiber）。Hexon作为免疫应答的主要抗原靶标,含有所有哺乳动物腺病毒共有的抗原区。Hexon loop ε区和Fiber knob可诱导特异性中和抗体产生。Fiber和Pentonbase与宿主细胞受体结合,同病毒感染进入有关。免疫功能正常个体感染HAdVs通常是自限性,而5岁以下婴幼儿、老人、免疫功能低下及接受器官移植的人群常导致重症感染,甚至引起死亡。我国尚未建立针对HAdVs感染的全国范围内的流行病学监测和报告系统,疾病预防控制机构无法进行早期感染疫情发现或发出预警;在临床诊断治疗措施上,国内外也没有食品和药品监督管理局已批准的特异性用于腺病毒治疗的抗病毒药物。目前,HAdVs感染诊断方法包括病毒分离培养、病毒抗原免疫荧光染色（immunofluorescent assay,IFA）和基于 PCR 扩增的病毒核酸检测（nuclear acid testing,NAT）等方法。虽然上述技术愈发成熟,但仍存在人员、机器和时间等多种限制因素,难以广泛推广应用于偏远贫困地区医疗,因而探求一种更加低成本、简单操作的诊断方法具有重要的意义。另一方面,由于有效治疗药物和措施的缺失,HAdVs感染后重症病例死亡率极高,免疫缺陷入群尤为突出。研究发现HAdVs重症感染者使用静脉高效免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin,IVIG）能抑制炎症因子及中和病毒,缓解病情。高本底血清抗HAdV-E4（IgG>1:32）抗体能提供免疫保护作用[1]。靶向腺病毒受体-整合素的单抗可阻止病毒的内化[2],干扰病毒感染。因此,获取有中和活性的单克隆抗体（Monoclonalantibody,mAb）有望成为临床治疗或预防性药物。本研究利用小鼠杂交瘤技术筛选制备了多株靶向HAdVs的单克隆抗体,并对这些单抗的抗原识别及中和功能进行了检测;利用其中两株对哺乳动物腺病毒广泛结合、高亲和力的单抗7E6和3C11,建立了免疫层析法（Immunochromatographicassay,ICA）,该方法能快速、特异性检测到多种哺乳动物腺病毒。本课题研究结果,如下:一、抗人腺病毒单克隆抗体的筛选、制备及功能鉴定1.通过HAdV-B3颗粒皮下多点免疫小鼠、脾细胞-骨髓瘤融合以及病毒颗粒结合ELISA筛选方法得到39株特异性HAdVs mAbs。所有阳性抗体克隆均特异性结合HAdV-B3,其中有24株广谱结合HAdV-C2、B3、C6和B7,1株广谱结合HAdV-B3、C6和B7,10株单抗对HAdV-B3和B7均结合,4株单抗特异性结合HAdV-B3。2.使用包被蛋白Hexon、Fiber对39株纯化mAbs进行了结合活性检测,其中19株mAbs特异性结合Hexon蛋白,其余20株mAbs为非Hexon结合。3.使用病毒斑点减少实验测试39株mAbs对活病毒HAdV-B3和HAdV-C1的中和活性,发现4株HAdV-B3特异性中和抗体2H4、5B12、3A3和1H10,IC50分别为 1.252、2.619、11.16和14.06μg/ml,其中2H4为Hexon结合抗体株,5B12、3A3和1H10是HAdV-B3非Hexon结合抗株;目前尚未发现广谱中和抗体。4.经包被蛋白Hexon间接ELISA检测获得2株高亲和力抗体7E6和3C11,EC50 分别为 4.60 x 10-3 和 9.87 x 10-2μg/ml。二、快速检测HAdVs的免疫层析分析方法的建立1.通过抗原结合ELISA筛选出2株高亲和力mAbs 7E6和3C11,用于建立基于ICA的HAdVs检测方法。2.利用8种相关病毒（包括呼吸道病毒和肠道病毒）验证ICA检测方法的特异性,病毒分别是人腺病毒、牛腺病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、鼠诺如病毒、轮状病毒、呼肠弧病毒和肠道病毒71型。该ICA能特异性结合哺乳动物腺病毒,其他6种病毒在高达104-106TCID50/ml下检测结果仍为阴性。3.同时,检测ICA对HAdVs不同型别的检测灵敏度,该ICA能特异性结合HAdV-C1,C2,B3,E4,C5,C6,B7,D10 胃肠型 HAdV-F41,极限范围为 0.16-103TCID50/ml。4.使用咽拭子样本评估ICA检测方法在临床应用的可行性。ICA检测10份Q-PCR确诊的HAdVs样本,结果发现该7份样本检测阳性,同时对这10份样本进行分离培养,其中7份样本分离培养结果阳性。ICA检测与病毒分离培养结果一致。结论本研究制备了 39株特异性HAdVs mAbs:有19株单抗为Hexon结合特异性抗体,其中2株单抗具有超高亲和力;有4株单抗对HAdV-B3具有中和抑制活性,尚未获得具有广谱中和活性的单抗。本研究获得的中和抗体对发展HAdVs治疗及预防具有潜在价值。用一对HAdVs配对的单抗成功建立了快速检测HAdVs的免疫层析分析方法,为HAdVs的临床诊断及偏远地区诊断应用推广提供了方法。