猫干扰素FeIFN-ω和FeIFN-α的克隆、表达和体外生物学活性研究

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猫干扰素omega(FeIFN-ω)属Ⅰ型干扰素,具有抗病毒,抗增殖和免疫调节功能。干扰素的生物学活性具有种属限制性,但也有报道,人IFN-ω对其他种属也有作用,而且较之IFN-α具有更为广谱的生物学活性和更高的抗病毒能力。干扰素的研究已有几十年的历史,但对猫源干扰素的研究,目前国内尚未见报道。1.本试验从感染猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的普通缅甸猫脾脏中克隆猫ω型干扰素基因(FeIFN-ω);以实验室保存的含猫α型干扰素基因(FeIFN-α)的质粒Pet-28a/FeIFN-α为模板,PCR扩增FeIFN-α成熟区域。利用分子生物学技术,分别构建原核表达载体pET-His/FeIFN-ω和pET-His/FeIFN-α,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),得到高效稳定的包涵体表达。通过包涵体洗涤和Ni-NTA亲和层析两步纯化,蛋白纯度能达到95%以上。2.本研究采用以细胞致病效应(CPE)抑制为基础的抑制微量测定法,根据结晶紫染色,利用酶标仪测定干扰素的抗病毒活性结果。试验从两个方面比较了干扰素FeIFN-ω、FeIFN-α的体外生物学活性,同时以日本干扰素产品Intercat?作为参照。第一,从干扰素广谱抗病毒活性方面,比较了三种干扰素亚型抵抗四种不同种属病毒的活性;第二,从干扰素生物学活性的种属限制性方面,比较了三种干扰素亚型在五种不同种属细胞上,抵抗水泡性口炎病毒的活性。结果显示,第一,重组猫ω型干扰素(FeIFN-ω)抵抗四种病毒的活性明显高于重组猫α型干扰素(FeIFN-α),尤其对H9N2亚型禽流感病毒(AIV),FeIFN-ω的活性是FeIFN-α的160倍,对犬瘟热病毒(CDV),FeIFN-ω的活性是FeIFN-α的4倍,而日本同类产品Intercat?对CDV和AIV均未表现活性。第二,FeIFN-ω在五种不同种属的细胞上均显示高效的抗病毒活性,在非洲绿猿猴肾细胞(VERO)和牛肾细胞(MDBK)上,FeIFN-ω抗VSV的活性能达到0.13×106U/mg,是FeIFN-α活性的15~30倍。在人宫颈癌细胞(HeLa)和猪肾细胞(PK-15)上,FeIFN-ω的抗病毒活性达到5×104U/mg,是FeIFN-α的100倍。而Intercat?只在猫肾细胞(CRFK)上表现抗病毒活性,在其他种属细胞系上均无活性。本研究这为下一步的临床研究提供了重要的理论依据,为寻求新的有效的动物抗病毒药物,构建高效的基因工程干扰素制品提供了理论依据和研究手段。
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