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环境污染物的神经毒性作用表现在多个方面，其中对运动神经系统尤其是肌肉发育的毒性作用逐渐引起关注。流行病学调查发现，多种环境污染物可以导致人群出现肌痛、肌无力等。进一步研究发现，污染物可以引发严重的肌肉发育毒性，甚至导致子代畸形等。例如二恶英暴露人群的流行病学数据显示其对运动系统的发育有不利的影响，肌肉病变及周围神经病变是二恶英职业暴露人群的主诉症状。但是由于相应毒理学研究的滞后，对污染物肌肉发育毒性的评价主要围绕动物在体实验研究展开，在微观机制的阐述及高通量毒性筛选方面的研究十分有限。因此本研究将应用运动系统发育相关的体外研究体系，构建一套细胞和分子水平的毒性评估系统，为实现污染物肌肉发育毒性高通量筛查奠定基础。 细胞模型构建方面:本研究选择C2C12细胞作为体外评价系统的细胞模型，并参考已有研究基础，建立了对C2C12细胞进行诱导分化的方法。采用逐级血清饥饿的方法诱导C2C12细胞分化，根据分化过程中一系列肌生成参数对诱导分化的效果进行了表征。结果表明，C2C12分化过程中单核的肌母细胞逐渐融合形成多核的肌管细胞，肌管细胞继续生长并成熟为梭形的肌管;肌管数目、细胞融合指数及肌管平均细胞核数等参数在分化过程中逐渐升高。肌球蛋白重链(Myosin heavy chain，MyHC)是肌管的重要结构蛋白，乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是肌肉神经支配发生的重要功能分子，主要来源于分化成熟的肌纤维，因此在分子水平上，选择了MyHC及AChE作为评价分化肌管结构及功能成熟的分子标志物。结果表明，MyHC基因及蛋白表达均呈逐渐上升趋势，AChE的表达水平及酶活性也随C2C12细胞的分化而显著升高。上述细胞形态的变化规律及分子表达的演化趋势与文献报道的肌生成过程一致，说明诱导分化模型构建成功。 系统的应用方面:近来有研究表明二恶英的肌肉毒性可能与肌生成过程有关。因此选择二恶英作为研究对象，从细胞及分子水平对其肌肉发育毒性进行了评估。选择了毒性最强的二恶英类同系物TCDD，应用连续给药方式开展毒性的筛查。结果显示低浓度TCDD(10-12～10-11mol/L)处理主要表现出对C2C12肌管形成的暂时性抑制作用，而较高浓度TCDD(10-10～10-9mol/L)处理对肌管形成过程的抑制作用更为明显，尤其对终末期的分化及肌管成熟度的抑制作用更为显著，具体表现为肌管数目、细胞融合指数及肌管平均细胞核数的下降，同时可造成肌管中MyHC表达的降低。由于AChE在肌肉神经支配发生中的重要性，开展了针对肌源性AChE表达的更加详细的毒性研究。结果表明，C2C12细胞在连续低浓度TCDD(3×10-12～10-10mol/L)处理后，表现出浓度依赖的AChE基因表达及酶活性的降低，阶段给药研究发现此抑制作用主要发生在分化中期。另外，在短期高剂量（30μg/kg体重，暴露一周）TCDD暴露后的小鼠肌肉组织中，也发现了TCDD对AChE基因表达的抑制作用。这一在体实验结果进一步证实肌肉是二恶英毒性的靶器官，AChE则是其运动功能干扰作用中的重要分子，提示开展针对肌源性AChE的二恶英神经毒理机制研究的必要性。 AhR信号通路是二恶英发挥毒性作用的经典途径，因此进一步探索了AhR信号通路在二恶英引发的肌源性AChE表达下调中的作用。结果表明，AhR拮抗剂CH22319无法有效的阻止TCDD对C2C12分化过程中AChE表达的抑制作用。进一步应用AHR敲除小鼠对体外的机制研究结果进行了初步验证。研究结果表明，TCDD短期高剂量（30μg/kg体重，暴露一周）暴露后，野生型及AHR敲除小鼠快肌组织中AChE的基因表达水平均有显著的下降。以上实验结果表明，AhR信号通路不能直接介导TCDD对肌源性AChE的抑制作用。 综上所述，本研究应用多种细胞及分子水平的评估参数构建了污染物肌肉发育毒性的评估方法，在污染物的运动系统发育毒性预测和风险评估方面具有科学意义。应用此评估系统初步揭示了二恶英肌肉发育毒性的细胞及分子基础，为二恶英运动神经毒性及机制研究提供了新数据。