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胚胎着床是哺乳动物生殖过程中至关重要的一步,子宫与胚胎之间的相互作用必须发生在一定的时间内,才能保证妊娠的顺利进行。在临床上,胚胎在正常的着床窗口外着床会导致妊娠损失的风险增加。前列腺素在雌性生殖过程中具有很重要的作用,包括排卵、受精、胚胎着床、蜕膜化和胎盘形成等。Cox-2、cPLA2α和Lpar3敲除鼠中胚胎着床延迟,着床前注射前列腺素可以使胚胎着床时间恢复正常,但并不能挽救cPLA2α和Lpar3敲除鼠中胚胎不均匀分布现象。尽管Cox-2和cPLA2α在生殖过程中发挥重要作用,但它们在子宫中的表达调节仍知之甚少。在胚胎着床点的基质细胞中COX-2、cPLA2α、EP1、EP4、PPARδ、C/EBPβ、STAT3及β-catenin等基因表达的部位非常相似,近些年研究表明PPARδ、C/EBPβ、STAT3、β-catenin与前列腺素相关基因间存在调控关系。本研究拟利用WesternBlot、Real-timePCR和荧光素酶分析等方法,对前列腺素相关基因在子宫内膜基质细胞中的调节机制进行探讨。
利用WesternBlot发现小鼠子宫内膜基质细胞中,PGE2处理15分钟后cPLA2β的505位丝氨酸磷酸化上调,这种上调具有浓度依赖性。PGE2处理24小时后,cPLA2α仍处于很高磷酸化状态,同时cPLA2α的mRNA和蛋白也有明显的上调。PGE2可以活化子宫内膜基质细胞中的p38、ERK1/2和JNK,PGE2对cPLA2a的磷酸化可以被MEK抑制剂U0126抑制,部分受p38抑制剂SB203580抑制。PGE2诱导的cPLA2α、p38和ERK1/2磷酸化可以被EP1拮抗剂所抑制,表明PGE2主要通过EP1/ERK调节cPLA2α的活化。小鼠子宫内膜基质细胞中PGE2还可以显著上调STAT3Tyr705的磷酸化和COX-2表达。在Cox-2启动子的-586～-579位置存在一个STAT3结合位点。把STAT3过表达载体与Cox-2启动子报告载体共表达,可以明显刺激启动子活性,把STAT3的Tyr705突变后则不能上调Cox-2启动子的活性,表明STAT3Tyr705磷酸化对Cox-2的启动子活性很重要。PGE2对STAT3的磷酸化以及对COX-2的上调可以被EP1拮抗剂、MEK抑制剂和STAT3抑制剂所抑制,表明PGE2通过EP1/ERK/STAT3通路调节COX-2的表达。
本研究发现,花生四烯酸在小鼠子宫内膜基质细胞中具有多种生物活性。它可以上调p38、ERK1/2和JNK的磷酸化,磷酸化水平在AA处理5分钟时最高。花生四烯酸对cPLA2α的磷酸化可以被MEK抑制剂U0126抑制,部分被p38抑制剂SB203580抑制,表明花生四烯酸主要通过ERK1/2调节cPLA2α的磷酸化。花生四烯酸处理1小时后可以明显上调Cox-2mRNA的表达,处理3小时后COX-2蛋白上调。花生四烯酸还可以诱导C/EBPβ的磷酸化和蛋白表达。经预测在Cox-2启动子-1053～+77区域内,有四个C/EBPβ结合位点。通过荧光素酶分析发现其中有两个位点对Cox-2启动子有调节,分别是-872～-864位点和-117～109位点。花生四烯酸对COX-2的诱导可以被p38抑制剂、MEK抑制剂、C/EBPβ的siRNA和抑制型C/EBPβ(LIP)所抑制。花生四烯酸诱导的C/EBPβ蛋白表达可以被p38抑制剂抑制,而C/EBPβ的磷酸化可以被p38抑制剂和MEK抑制剂抑制。总之,花生四烯酸通过C/EBPβ调节COX-2的表达,而C/EBPβ的活化受p38和ERK1/2调控。二十碳四炔酸ETYA是花生四烯酸的类似物,它可以作为假底物不被环氧合酶和脂氧化酶代谢,因此可以用来验证AA本身的功能。ETYA处理基质细胞后,COX-2和C/EBPβ明显上调,cPLA2α、p38、ERK1/2、JNK和C/EBPβ的磷酸化也上调,表明花生四烯酸可以不依赖前列腺素和白三烯的生物合成,独立发挥作用。
基于本研究的数据,小鼠子宫内膜基质细胞中AA和PGE2可以促进cPLA2α/COX-2通路活化,形成了前列腺素的正调节通路。由于前列腺素的不稳定性,正调节通路的存在对于子宫中前列腺素的持续产生是非常重要的。