论文部分内容阅读
目的：建立可以稳定表达红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3(RFP-GFP-LC3)的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系,为自噬研究提供材料。研究结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)对小鼠巨噬细胞自噬的影响,探究Rab7在结核杆菌毒力因子SapM诱导的自噬体-溶酶体融合阻断中的作用。方法：1用分子克隆的方法构建含RFP-GFP-LC3基因的慢病毒重组质粒载体,将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,收集病毒液上清后感染RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选获得稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株,分别用荧光显微镜和流式细胞仪分析感染效率。饥饿处理稳定感染的细胞,荧光显微镜下观察细胞内的RFP-GFP-LC3斑点。2.分别用SapM.渥曼青霉素、饥饿处理GFP-LC3-RAW264.7细胞。荧光显微镜下观察自噬体的形成,Western blot法检测微管相关性蛋白轻链3(LC3)Ⅱ水平；再用SapM处理GFP-LC3-RAW264.7细胞后加氯喹,Western blot法检测LC3Ⅱ水平。3.siRab7转染RAW264.7细胞,用蛋白免疫印记检测P62。mCherry-SapM转染RAW264.7后免疫组化分析SapM与Rab7共定位情况,免疫共沉淀分析SapM与Rab7的关系。用三种SapM的突变体SapM△arcA, SapM△FReD和SapM△CT转染RAW264.7细胞,分析SapM的不同突变体与Rab7的关系。结果：1.成功构建了慢病毒载体pLV-CMV-RFP-GFP-LC3,经感染和嘌呤霉素筛选获得了稳定表达RFP-GFP-LC3的RFP-GFP-LC3-RAW264.7细胞；2.SapM和饥饿均导致GFP-LC3斑点增多和LC3Ⅱ水平增高,在SapM处理的细胞中加入氯喹并没有引起LC3Ⅱ的进一步升高。3.siRab7处理后,细胞P62水平显著增高；免疫组化显示SapM与Rab7在胞内共定位：免疫共沉淀分析显示SapM与Rab7可相互沉淀；三种不同突变形式的SapM中,只有SapM△cT不能与Rab7相互作用。结论：稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株成功建立,为自噬的研究建立了细胞平台。SapM可阻断自噬体与溶酶体的融合,从而抑制小鼠巨噬细胞自噬。SapM诱导的自噬体-溶酶体融合阻断依赖于SapM与Rab7的相互作用。