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种子的休眠与萌发是植物生长发育的重要过程,它能确保种子安全度过恶劣的气候并在环境适宜的时候正常萌发生长。这一过程受到温度、湿度、光照等多种因素控制,而脱落酸(ABA)在其中发挥着重要的作用。
胡萝卜作为第一种通过组织培养获得体细胞胚的植物,在植物胚发育研究中一直发挥着重要的作用。体细胞胚与合子胚的发育过程非常相似,但在正常生长情况下体细胞胚不会进入休眠状态,而是直接发育成为幼苗。黄美娟等人发现胡萝卜体细胞胚在含有6%蔗糖的培养基中,发育静止在鱼雷胚晚期,在低于3%蔗糖的培养基中又能够继续生长,形态学研究、内源ABA测定结果及基因表达水平检测结果均表明该体系与种子的休眠与萌发过程有很多相似之处。
我们以处于鱼雷胚晚期阶段的胡萝卜体细胞胚为材料,构建cDNA-GAL4 AD融合文库,利用酵母单杂交技术得到了6个能够与ABA应答元件ABRE结合的基因,其中5个基因含典型的bZIP类DNA结合结构域,而第六个是bHLH类型转录因子。我们从中选择了两个基因进一步研究,分别命名为CAREB1和CAREB2。凝胶阻滞实验证明,CAREB1与CAREB2都能够在体外结合ABRE元件,酵母单杂交实验及胡萝卜悬浮细胞的瞬时表达实验证明CAREB1和CAREB2都能够特异地识别LEA基因家族成员Dc3启动子中的ABA应答元件,并激活下游报告基因的转录。Northern分析表明,CAREB1与CAREB2在表达模式上存在明显的差异,CAREB1在体细胞胚发育后期表达量升高,并与这一时期内源ABA含量密切相关;而CAREB2在植株对干旱以及外源ABA的处理过程中表达量明显升高。结果显示,虽然CAREB1与CAREB2能够识别相同的DNA元件,但是它们却在胡萝卜发育的不同时段行使着不同的功能。
为进一步研究CAREB1在体细胞胚发育过程中的作用,我们改进了已有的胡萝卜转基因体系,利用这一新的转基因体系,我们可以在短时间内得到大量的转基因体细胞胚。转基因实验表明,过表达CAREB1的胡萝卜体细胞胚在含有3%蔗糖的培养基中发育明显减慢。在含有1%蔗糖的培养基中,CAREB1过表达体细胞胚的胚根不能正常延伸,并且不能发育成为幼苗。CAREB1在胡萝卜体细胞胚发育过程中的调控作用还有待深入的研究。