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广州管圆线虫病是广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonesis)感染引起的一种人兽共患寄生虫病。广州管圆线虫进入人体后主要侵犯中枢神经系统，引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎或脑膜脑炎。临床上表现主要表现为剧烈头痛且止痛药难以缓解、发热、嗜睡、恶心、呕吐等症状，神经症状明显，除了头痛、颈项强直等脑膜刺激征外，还伴有皮肤感觉异常，肢体疼痛乏力，严重者可至昏迷甚至死亡。我国是广州管圆线虫病的主要流行区之一，近年来我国不断出现新发病例，在多个省份甚至出现了暴发流行。如何有效的防治广州管圆线虫病已成为亟待解决的问题。但到目前为止，对于广州管圆线虫病致病机制和防治药物的研究非常有限。根据其他寄生线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)研究报道，cystatin可以调有利于其逃避宿主免疫应答，作为免疫调节剂在寄生虫抗感染中有较好的应用前景。本研究对广州管圆线虫的cystatin基因进行了克隆表达并对其免疫保护作用作了初步研究，为抗广州管圆线虫病的新疫苗、新药物的研制以及广州管圆线虫逃避宿主免疫应答机制研究奠定基础。
研究目的
分析广州管圆线虫cystatin基因及其推导氨基酸序列的基本特性和结构特点，构建cystatin基因原核表达系统，优化表达系统，获得纯化蛋白，并对其免疫保护作用作出初步鉴定，为抗广州管圆线虫病的新疫苗、新药物的研制奠定基础。研究方法从广州管圆线虫幼虫cDNA质粒文库测序得到的全长Uinegene中识别编码cystatin基因的完整读码框，并对其进行同原性分析和结构预测，看其属于cystatin哪个家族。PCR方法体外扩增该基因进行T-A克隆并进而构建原核表达载体pGEX-cystatin，转化入大肠杆菌BL21表达融合蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析鉴定后大量表达并纯化蛋白。将分离纯化融合蛋白免疫小鼠，进行免疫保护效果的观察。
研究结果
1.获得了广州管圆线虫cystatin基因的完整读码框，其氨基酸序列与巴西日圆线虫cystatin相似性最高，达70％，其次为秀丽隐杆线虫的cystatin-C以及捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)的cystatin-1分别为62％和50％，具有cystatin的完整保守结构域，有一个链内二硫健，无跨膜结构和信号肽，可能属cystatin超家族中cystatins家族(家族2)成员。
2.成功克隆扩增了目的基因并T-A克隆致pMD-18-T载体，获得高拷贝量的目的基因。构建的pGEX-cystatin重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定以及测序结果分析，表明成功构建了cystatin基因的原核表达载体。
3.将构建的pGEX-cystatin重组质粒成功转化入大肠杆菌BL21，诱导表达后获得融合蛋白，经SDS-PAGE分析与目的蛋白理论分子量相符，Western-blotting分析重组蛋白可以被抗GST抗体识别。表达产物经亲和层析纯化后得到纯化的融合蛋白。
4.将纯化目的蛋白免疫小鼠，免疫三次后进行广州管圆线虫三期幼虫攻击感染，观察免疫保护效果。与对照组相比，目的蛋白免疫后抗体水平显著升高，并获得了51.8％的减虫率和20％的保护率。
结论
1.获得了广州管圆线虫cystatm基因的序列，成功构建了pGEX-cystatin重组质粒，并在大肠杆菌中表达重组融合蛋白。
2.纯化的目的蛋白后免疫小鼠，能诱导小鼠产生抗管圆线虫保护性免疫力，cystatin蛋白对小鼠具有免疫保护作用，但其作用机制需进一步实验证实。