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大肠杆菌(Escherichia coli)具有遗传背景清楚、生长速度快、生长周期短、安全性好、可以进行高密度培养和适合表达不同基因产物等特点,是科研和工业生产上表达外源基因的常用宿主。然而,外源基因的诱导表达常会给宿主造成强烈的代谢负担,导致菌体生长下降及自身蛋白合成产物减少,这方面国内外已经有很多的研究报道。综合分析国内外的研究成果,我们发现,迄今对带有T7强启动子的pET表达载体的研究报道甚少,而且采用非变性SDS-PAGE技术来研究外源基因表达对宿主菌的影响也罕有报道。
本研究以Escherichia coli BL21(DE3)和带T7启动子的pET。载体的诱导表达为研究对象,通过对宿主菌生长曲线测定,全菌蛋白非还原性SDS.PAGE分析和差异蛋白的串联质谱鉴定等研究方法,考察了IPTG诱导pET质粒外源基因表达对宿主菌生理和蛋白表达的影响,主要研究结果如下:
1)大肠杆菌生长曲线测定结果:带外源基因的pET质粒和空载的pET质粒经IPTG诱导表达对宿主菌的生长造成严重的抑制作用,实验组的OD600nm值比对照组平均减少53.56%,而且宿主菌对外界环境变化的应激力下降。
2)大肠杆菌总蛋白含量测定结果:表达外源基因的宿主菌的总蛋白含量比不经诱导的宿主菌减少40.86%,说明pET质粒的强烈表达使得宿主菌蛋白的表达明显减少。
3)全菌蛋白电泳图谱结果:带有质粒并经诱导表达的宿主菌的蛋白PAGE胶上有两条蛋白条带明显消失,消失时间是在加入诱导剂0.5h-1h之间,而且蛋白消失后菌体表现为生长受阻,生长曲线OD600nm值不增长。
4)MALDI-TOF MS/MS鉴定结果:消失的蛋白分别为Outer membrane protein F(OmpF)和Bacterioferritin(Bfr),OmpF是细胞外膜的重要的结构蛋白,可形成对小分子亲水物质进行被动运输的膜孔道,Bfr主要起菌体内铁离子的解毒和储存铁离子的作用。
全文研究结果表明带有T7强启动子的pET质粒表达对宿主菌大肠杆菌产生严重的代谢负担,导致宿主菌生长受抑制,生命力下降,细胞分裂受阻,这些结果和前人研究其它质粒时的结果相一致,同时发现质粒上外源基因表达使宿主细胞自身蛋白表达也受到影响,表现为蛋自的不表达或表达量下降,令人感兴趣的是我们还发现了蛋白OmpF和Bfr在诱导后短时间内就明显消失这一未经报道过的现象。