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锑(Antimony, Sb)是剧毒类金属，与同主族的砷(Arsenic，As)有很多相似的理化性质。由于锑的广泛应用、锑矿的开采以及锑化物的大量生产使锑污染问题日益严峻，严重危害人类健康。锑氧化型细菌可将毒性强的三价锑类物质[Antimonite，Sb(Ⅲ)]氧化为毒性弱的五价锑[Antimonate，Sb(Ⅴ)]类，降低锑对细菌和环境的毒性。因此，研究细菌中的锑代谢、鉴定新型锑氧化酶、阐明锑氧化机制对环境锑循环和锑污染治理均具有重要意义。近年来国际国内学者对锑转化的研究日渐重视，但在本人硕士研究开始之前(2012年)，微生物Sb(Ⅲ)氧化的分子机制仍是空白。本研究团队近年来发现了多种异养型锑氧化细菌，本论文以异养型砷/锑氧化菌Agrobacteriumtumefaciens GW4为材料，研究了锑氧化及能量代谢机制，主要研究内容和结果如下: 1.首次发现了以NADP+为辅酶的Sb(Ⅲ)氧化酶AnoA。通过前期蛋白质组学研究发现氧化还原酶AnoA在Sb(Ⅲ)条件下表达量上调;荧光定量和报告基因融合的方法证实anoA基因的转录受不同浓度Sb(Ⅲ)的诱导;基因的同框缺失敲除、互补及超表达实验证明anoA与菌株的Sb(Ⅲ)表型密切相关;缺失anoA基因使Sb(Ⅲ)氧化速率（下降～27％）及抗性下降，互补株表型回复，超表达anoA使Sb(Ⅲ)氧化速率升高～34％;表达纯化AnoA蛋白进行体外酶反应动力学实验，结果表明AnoA能够在体外以NADP+为辅酶直接催化Sb(Ⅲ)的氧化，Km为64±10μM，Vmax为150±7nmolmin-1 mg-1;此外，由于砷、锑结构的相似性，AnoA还能够在体外催化As(Ⅲ)的氧化，但AnoA与底物As(Ⅲ)的亲和力以及酶反应速率均不如Sb(Ⅲ);在E.coli中异源表达AnoA能够显著提高菌株Sb(Ⅲ)的氧化速率。以上结果表明AnoA为细菌体内新型Sb(Ⅲ)氧化酶，但细菌中仍然存在着其它氧化Sb(Ⅲ)的因子。 2.阐明了细胞内产生的H2O2能够作为非酶促因子氧化Sb(Ⅲ)至Sb(Ⅴ)。Sb(Ⅲ)能够诱导细胞产生氧化压力从而产生大量H2O2;能够将H2O2分解为H2O和O2的过氧化氢酶基因katA受不同浓度Sb(Ⅲ)和H2O2的诱导且在菌株对Sb(Ⅲ)和H2O2的抗性中起重要作用;敲除katA基因后，菌株GW4-ΔkatA的氧化速率显著加快，且细胞内H2O2含量显著增加，互补株表型回复;在细菌体内，随着细胞的生长，H2O2含量逐渐下降，而Sb(Ⅲ)氧化生成的Sb(Ⅴ)含量逐渐升高(R2=0.93，P＜0.05)，说明细菌体内逐渐减少的H2O2用于氧化Sb(Ⅲ);在培养基中，Sb(Ⅲ)过量的条件下，添加的H2O2浓度越高，Sb(Ⅲ)氧化生成的Sb(Ⅴ)含量越多，呈正相关(R2=0.94，P＜0.05)。以上结果表明Sb(Ⅲ)诱导产生的氧化压力与菌株对Sb(Ⅲ)氧化及抗性密切相关，胞内H2O2作为非酶促因子氧化Sb(Ⅲ)能够同时降低Sb(Ⅲ)和氧化压力对细胞的毒害，是细菌中一种重要的“以毒攻毒”的机制。 3.鉴定了砷氧化酶AioAB在菌株GW4的Sb(Ⅲ)氧化过程中的作用。砷氧化酶AioAB能够在细胞周质氧化As(Ⅲ)为As(Ⅴ)。前期研究表明AioAB在A.tumefaciens5A中也能够催化Sb(Ⅲ)的氧化，aioA基因的缺失使菌株5A的Sb(Ⅲ)氧化速率下降。本研究中，我们发现在A.tumefaciens GW4中敲除aioA基因后菌株GW4的氧化速率加快;荧光定量PCR结果表明这是由于aioA基因的缺失能使锑氧化酶基因anoA和过氧化氢酶基因katA上调表达;此外，加锑条件下突变株GW4-ΔaioA细胞内H2O2含量也比野生型明显增加，互补株的表型回复，说明缺失aioA后细胞内AnoA催化的酶促和H2O2介导的Sb(Ⅲ)氧化均会上调。以上结果表明AioAB在菌株GW4中作用并不显著，但通过影响AnoA和KatA的表达来参与锑氧化。 4.阐明了菌株GW4中Sb(Ⅲ)和砷氧化酶AioAB对锑响应代谢途径和能量产生的影响。通过前期蛋白质组学研究结合基因的转录和代谢通路分析，发现Sb(Ⅲ)能够诱导菌株GW4和突变株GW4-ΔaioA中Sb(Ⅲ)氧化和抗性、压力响应、碳代谢、细胞运动性、磷酸盐和磷酸酯代谢、核苷酸和氨基酸代谢等相关蛋白/基因的表达;且在加Sb(Ⅲ)条件下，菌株GW4-ΔaioA中这些代谢路径蛋白/基因上调更显著。因此我们认为这是由于细胞周质Sb(Ⅲ)氧化消失后，Sb(Ⅲ)对细胞造成了更多的毒害作用，因此细胞质中AnoA和氧化压力相关的蛋白均上调，加快细胞内Sb(Ⅲ)的氧化;同时，TCA循环上调从而产生更多的能量供菌株生长并抵御Sb(Ⅲ)的毒性;Sb(Ⅲ)氧化过程中产生的能量用于Sb转运、DNA损伤修复、蛋白质的合成、细胞运动等。 综上，本论文通过对异养型Sb(Ⅲ)氧化菌GW4的系统研究，发现了新型锑氧化酶，首次提出了细菌的Sb(Ⅲ)氧化是一个由酶促反应(AnoA，AioAB)和非酶促反应(H2O2)共同组成的共代谢过程。此外，还阐明了砷氧化酶AioAB对Sb(Ⅲ)压力响应代谢路径和能量产生的影响，解析了菌株GW4在加Sb(Ⅲ)条件下的能量代谢机制。本论文的结果已在国际期刊系列发表，极大地丰富了对微生物Sb(Ⅲ)氧化机制的认识。此外，基于这些发现和近年国际上的研究进展，在国际上首次发表了微生物锑转化研究的综述文章，为解析微生物在锑地球化学循环中的作用和锑污染环境的微生物修复提供了理论基础。