白僵菌素高含量菌株的筛选及其杀虫活性研究

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球孢白僵菌是一种主要的昆虫病原真菌,在害虫生物防治中发挥着十分重要的作用。本文从球孢白僵菌不同菌株致病力、白僵菌素高含量菌株的筛选、白僵菌素含量动态变化、提取分离、制备纯化、杀虫活性、以及对昆虫酶活力的影响等几个方面进行了研究。主要结果如下: ⑴球孢白僵菌不同菌株致病力与白僵菌素含量测定。球孢白僵菌40个菌株对斜纹夜蛾及小菜蛾的致病力测定结果表明,球孢白僵菌对这两种害虫均具有较强的致病力。通过采用高效液相色谱检测白僵菌素,对40株球孢白僵菌白僵菌素含量进行了测定,结果表明:菌株间白僵菌素含量差异明显,菌株Bb28自僵菌素含量最高,为227.61μg/mL;最低的是Bb37和Bb39菌株,含量为0μg/mL;白僵菌素含量在100μg/mL以上的菌株共15株;40株球孢白僵菌白僵菌素平均含量为79.46μg/mL。 ⑵培养基、紫外诱变对白僵菌素含量的影响。①球孢白僵菌Bb28菌株在SDY、YC、PC、PD四种液体培养基中摇瓶发酵培养30 d内白僵菌素含量的测定结果表明,该菌株在四种液体培养基中均能生产白僵菌素,在SDY中的白僵菌素含量最高,其次是YC,PD最低,PC居中。培养至12 d时,SDY、YC中菌体白僵菌素含量最高,分别为280.69μg/mL、232.22μg/mL。在四培养基中,Bb28白僵菌素含量在1—30 d内均有一个先升高后降低的动态变化过程,但具体存在差异。在SDY中,存在一个长达12 d的白僵菌素高产稳定期,在第12—24 d内,其含量变化平缓,保持在230-280μg/mL之间变化,其他三种中则无此现象:相对菌株进入生物量稳定期的时间,其白僵菌素进入高产期的时间则滞后2d,此滞后现象也存在于YC、PC、PD中,但存在差异。②五种固体培养基中Bb28白僵菌素含量测定结果表明,花生最有利于菌体生产白僵菌素,其白僵菌素含量最高,达到351.17μg/g,显著高于黄豆培养所得(203.95μg/g),也显著高于大米、玉米、小麦处理。③添加一定量的苯丙氨酸和β—丙氨酸能够提高菌体白僵菌素含量,SDY培养液中,两者2000μg/mL处理分别增产20.24%和37.58%。添加斜纹夜蛾幼虫虫体匀浆液增效显著,白僵菌素含量随着虫体重量的增加而升高。每100 mLCzapek培养液中添加8g虫体其白僵菌素含量是对照的13.06倍。④通过紫外线诱变菌株分生孢子可以获得白僵菌素高含量菌株,以Bb28作为出发菌株,利用紫外线诱变其分生孢子,共筛选了50个诱变株。白僵菌素含量最高的是VBb22菌株,增产28.52%。 ⑶白僵菌素提取分离及制备纯化。溶剂、浸泡提取的时间、菌体烘烤的时间均会影响白僵菌素的提取含量。几种供试溶剂中,丙酮处理提取含量最高,其值为143.33±4.86μg/mL,其次为甲醇处理白僵菌素含量为137.62±7.06μg/mL,显著高于无水乙醇处理。综合考虑毒性、廉价,易购等因素,本文选择甲醇做为提取白僵菌素的溶剂。白僵菌素被溶剂萃取出来的含量随着提取时间的延长而呈有规律的变化,先上升后缓缓下降,浸泡时间和提取含量之间存在一定的数量关系,两者关系式为:y=-0.9935x2+23.29x+5.1059,R2=0.780。随着菌体烘烤时间的延长,其白僵菌素含量先升高,后降低,烘烤1d时含量最大,达到221.99μg/mL。超声波和真空冷冻干燥有利于白僵菌素的提取,采用冷冻干燥的白僵菌素含量为常规处理的两倍有余,超声处理1h的含量是其对照的1.86倍。采用丙酮—石油醚(40:60)作展开剂,白僵菌素在GF254硅胶薄板上的Rf一般稳定在0.61左右。采用硅胶柱层析,丙酮—石油醚溶剂系统梯度洗脱,可以分离得到白僵菌素,白僵菌素在丙酮—石油醚(20:80)部分被洗脱出,减压浓缩,经反复柱层析,纯度为92.19%。低温挥发溶剂后玻璃壁上会有其白色针状晶体结出。 ⑷白僵菌素对小菜蛾和斜纹夜蛾的毒力。生物测定结果表明:①白僵菌素对其二龄幼虫均有较强的触杀毒力,药效主要表现在4 d内。②血腔注射法结果表明,白僵菌素对斜纹夜蛾六龄幼虫具有很高的毒力,药后12 h,160(μg/头)处理的校正死亡率最高,达到69.26%,但10(μg/头)处理仅为3.33%。药后6、12、18、24、30 h,白僵菌素注射斜纹夜蛾六龄龄幼虫的致死中量LD50分别为103,42、76.28、43.74、22.79、16.16(μg/头);LD90分别为518.75、335.75、242.40、133.63、33.46(μg/头)。 ⑸白僵菌素对斜纹夜蛾酶活力的影响。白僵菌素被注射到斜纹夜蛾六龄幼虫血腔中后,会引起虫体内蛋白质含量的降低,同时还会引起PPO、CarE、GSTs酶比活力发生变化。处理24 h后,PPO比活力表现为降低。3—24 h内表现为CarE比活力高于对照,但3—9 h酶活急速下降。3—24h内,白僵菌素表现为激活谷光甘肽—S—转移酶,比活力始终高于对照。
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