E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-cr羰基还原酶酶学性质研究及其催化制备他汀手性砌块

来源 :浙江工业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:psty2006
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6-氰基-(3iR,5R)-二羟基己酸叔丁酯、(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)是他汀类药物的重要手性砌块和药效基团,由于化学和光学选择性要求高而成为他汀类药物合成的重点和难点。论文建立了生物法不对称还原催化合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)、6-氰基-(3R,5R-二羟基己酸叔丁酯技术,具有反应条件温和、催化效率高以及产物光学纯度高等优势。本文基于前期的研究基础上,从实验室构建的羰基还原酶菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-cr细胞中分离得到电泳纯NADP(H)依赖型的羰基还原酶,LC-MS-QTOF分析揭示其相对分子质量为35.4 kDa。在纯酶的基础上对羰基还原酶的酶学性质进行表征:该羰基还原酶最适反应条件为30℃,pH 7.5,对热的稳定性较低,但是pH稳定范围较宽,在pH值为6.0~8.0范围内较稳定。对该羰基还原酶的底物谱进行研究发现该羰基还原酶对底物(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(CHOHB)、4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)活性较高,同时对双羰基底物丙酮酸乙酯、丁二酮也表现出较好的还原能力,除此之外对芳香酮、脂肪酮、醛以及酮酯均具有还原能力。羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶构建辅酶循环体系,催化底物4-氯-乙酰乙酸乙酯(COBE)还原生成产物(S)-4-氯-3-羟基乙酸丁酯(CHBE)。在KH2PO4-K2HPO4缓冲体系中催化100 mmol·L-1底物COBE 15 min后反应完全,转化率为100%。e.e.大于99.9%,但是当底物浓度提高时表现出严重的底物和产物抑制。利用水/邻苯二甲酸二丁酯双相体系改善催化反应过程中的底物和产物抑制,相比例为1,搅拌速度为200 rmin-1,催化300 mmol.L-1 COBE 80 min反应完全,转化率为100%,产物浓度为294.2 mmol·L-1,e.e.大于99.9%。通过底物浓度对酶活影响的测定,利用Lineweaver-Burke作图法求出羰基还原酶催化底物CHOHB还原反应各动力学参数,KiNADPH=1.9×10-2 mmol·L-1、vmax=54.3μmol·mg-1·min-1、KmNADPH=4.3×10-2mmol·L-1、KmCHOHB=4.4 rmmol·L-1,并得到反应的动力学方程为:v=543[CHOBH][NADPH]/(0.0836+0.043[CHOBH]+44[NADPH]+[CHOBH][NADPH])°通过对底物浓度对羰基还原酶酶活影响的测定,同理,求出羰基还原酶以COBE为底物时还原反应各动力学参数,KiNADPH=2.3 X 10-2 mmol·L-1、vCOBEmax=36.5μmol·mg-1min-1、KmNADPH=2.2× 10-3mmol·L-1、KmCOBE=0.12 mmol·L-1,并得到反应的动力学方程为:v=36.5[COBE][NADPH](0.00276+0.0022[COBE]+0.12[NADPH]+[COBE][NADPH])°菌株E.colBL21(DE3)/pET28a(+)-cr在他汀侧链中间体(5)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)、6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯合成中是良好的生物催化剂,具有良好的工业化应用前景。
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