日本血吸虫SjTrx结构及SjTrx-SjTGR蛋白复合物的结晶学研究

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流行于热带及亚热带地区国家的血吸虫病(Schistosomiasis)严重危害人类生命健康、影响人们的正常生产活动,是一个世界性的公共卫生难题。我国境内主要流行的类型为日本血吸虫病(Schistosoma japonicum)。血吸虫的生存需要有效的机制来维持细胞的氧化还原平衡。硫氧还蛋白系统(Thioredoxin system,Trx system)广泛存在于各种生物体,也是日本血吸虫体内重要的抗氧化系统。该抗氧化系统以日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(Thioredoxin glutathione reductase from Schistosoma japonicum,SjTGR)为中心,以日本血吸虫硫氧还蛋白(Thioredoxin from Schistosoma japonicum,SjTrx)为电子传递底物,在驱动参与保持氧化还原平衡的反应中发挥着重要的作用。本论文对日本血吸虫硫氧还蛋白(SjTrx)进行了克隆、表达、纯化、活性表征及三维结构解析工作。同时,我们制备了SjTrx与日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)的蛋白复合物并进行初步结晶学研究,为阐明该系统在保持日本血吸虫氧化还原平衡中的作用机制提供结构上的信息。主要内容包括:(1)制备得到大量可用于结构功能研究的重组wtSjTrx蛋白酶。从日本血吸虫成虫cDNA文库中克隆得到wtSjTrx目的基因,并通过一步克隆法将目的基因插入表达载体pET28a,构建成功wtSjTrx-pET28a重组表达载体;通过IPTG诱导wtSjTrx-p ET28a在大肠杆菌菌株BL21(DE3)实现了可溶性表达;经过Ni离子亲和层析纯化和DEAE弱阴离子柱两次纯化,获得纯度95%以上的wtSjTrx目的蛋白。(2)表征了重组wtSjTrx蛋白酶的生物活性。通过胰岛素还原实验确定了wt SjTrx具有还原活性,测定了重组wtSjTrx蛋白酶与日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)的相互作用,确认了wtSj Trx蛋白酶的生物活性。(3)解析了重组wt Sj Trx蛋白酶的晶体结构。利用高纯度浓缩后的重组wtSj Trx为材料进行结晶,成功获得具有高衍射分辨率的蛋白晶体;X-射线衍射数据结果表明其分辨率为2.0?,晶体结构解析结果阐明了该蛋白酶的三维结构以及活性位点的结构特征。(4)设计制备得到了SjTGRC596S和SjTrxC37S突变体蛋白。利用定点突变技术实现了基因的定点突变,并分别制备了突变体蛋白SjTGRC596S和SjTrxC37S。(5)探索制备了SjTGRC596S和SjTrxC37S两突变体蛋白酶的复合物。以过量的SjTrxC37S与SjTGRC596S蛋白酶按1:5的比例,在体外4℃孵育24 h后,通过Superdex 75凝胶柱实现了SjTGRC596S-SjTrxC37S蛋白复合物的制备及分离纯化。(6)进行了SjTGRC596S-SjTrxC37S复合物结晶学的初步研究工作。制得的蛋白复合物浓缩至10mg/mL后,进行结晶条件的筛选。优化条件后得到的蛋白复合物晶体经X-射线衍射,收集到一套分辨率为4.0?的衍射数据。
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