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目的关节置换术后假体周围感染（periprosthetic joint infection,PJI）是关节置换手术后最灾难性的并发症。急性PJI的治疗因为创伤小、花费少、远期疗效好而越来越受到重视。然而甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）的出现给PJI的治疗带来了灾难性后果。MRSA感染的PJI治疗失败率很高,目前主要依靠万古霉素治疗,然而万古霉素强效治疗细菌感染的同时,给患者身体健康也带来了较大的毒副作用。光动力疗法（photodynamic therapy,PDT）即利用一定波长的光激发已存在于细胞内的光敏剂而引发光化学效应,与周围的氧发生反应产生活性氧,作用于细胞产生杀伤作用。姜黄素本身具有一定的抗菌作用,同时近来有研究发现姜黄素是一种高效、低毒的新型光敏剂。但是姜黄素的激发波长在200-230nm和410-450nm,组织穿透能力较低。尽管像980nm的近红外光的组织穿透深度远大于可见光（400-700nm）的穿透深度,但因为其不在姜黄素的吸收波长范围内,所以不足以激发姜黄素产生光动力作用。掺杂有稀土的上转换发光纳米颗粒具有将980nm的近红外光转换成400-500nm波长区域光的特性,同时纳米颗粒也增加药物的水溶性和稳定性,且能够长药物体内循环时间和提高靶向部位药物浓度,现已成为姜黄素输送体系的主要研究方向。因此,本文拟主要研究（1）体外检测姜黄素在450nm激光的激发下产生活性氧情况以及对MRSA杀伤情况。（2）合成上转换发光纳米颗粒,并构建姜黄素-上转换发光纳米颗粒共轭复合物,检测其理化性能以及细胞毒性。（3）体外检测在980nm近红外光激发下,姜黄素-上转换发光纳米颗粒共轭复合物对MRSA的杀伤情况。（4）构建急性感染MRSA型PJI动物模型,体内探索研究980nm近红外光作用下姜黄素-上转换发光纳米颗粒共轭复合物对急性MRSA型PJI的治疗情况。方法:1.体外检测姜黄素在450nm激光的激发下产生活性氧情况以及对MRSA杀伤情况。首先利用活性氧绿色荧光探针（singlet oxygen sensor green,SOSG）检测450nm激光激发下姜黄素产生的活性氧的情况;其次对MRSA菌株进行分离培养,并通过麦氏浊度仪进行分离将菌液浓度0.5麦氏浊度单位（McFarland,MCF）,冷藏待用;将实验组分为单纯姜黄素组、单纯光照组、姜黄素-激光照射组、空白对照组四组,分别用450nm激光照射5min,辐照强度为1 W/cm2;利用稀释平板法检测MRSA。2.合成上转换发光纳米颗粒,并构建姜黄素-上转换发光纳米颗粒共轭复合物,检测其理化性能以及细胞毒性。通过水热法制备上转换纳米颗粒,利用激光粒径分析仪检测合成的上转换发光纳米颗粒的粒径分布及Zeta电位;应用X射线衍射手段检测上转换发光纳米颗粒的组成成分;利用扫描电镜以及透射电镜对上转换发光纳米颗粒形态学进行鉴定,并利用荧光光度计检测其在980nm波长激发下的上转换发光特性;利用二氯甲烷气化法通过分子间离子键及氢键等作用构建姜黄素-上转换发光纳米颗粒共轭复合物;利用激光粒度分析仪测姜黄素-上转换发光纳米颗粒共轭复合物的粒径分布及Zeta电位;利用透射电镜以及扫描电镜对共轭复合物形态学进行鉴定;利用热重分析和傅里叶红外光谱测定共轭复合物组成成分;根据光漂白现象,利用SOSG绿色荧光探针检测共轭复合物可在980nm近红外光激发下产生活性氧的情况;利用鼠前成骨细胞的CCK-8实验检测姜黄素-上转换发光纳米颗粒共轭复合物的细胞毒性。3.姜黄素-上转换发光颗粒共轭复合物体外杀菌实验。首先进行MRSA菌株培养及含量测定,对拟定采用MRSA标准菌株进行分离和培养,并通过麦氏浊度仪进行分离将菌液浓度0.5MCF,冷藏待用;第二,测定姜黄素-上转换纳米发光共轭复合物最低抑菌浓度（MIC）的以及最适宜980nm近红外光照射时间,为进一步的体外杀菌实验探索适宜条件。第三,姜黄素-上转换纳米发光共轭复合物体外杀菌评价。向各组MRSA菌液中分别加入了磷酸缓冲盐溶液、单纯上转换发光纳米颗粒、单纯姜黄素、以及低浓度姜黄素-上转换纳米发光共轭复合物和高浓度姜黄素-上转换纳米发光共轭复合物,分别进行无光照和有光照处理,处理完毕之后,再将对各组处理液进行细菌培养和菌落计数。4.构建急性感染MRSA型PJI动物模型,体内探索研究980nm近红外光作用下姜黄素-上转换发光纳米颗粒共轭复合物对急性MRSA型PJI的治疗情况。首先构建大鼠关节急性MRSA型PJI模型,并将模型动物分组,将生理盐水,姜黄素以及不同浓度的共轭复合物分别经关节腔注射入动物模型体内,之后给予980nm近红外光照射,3天之后处死动物,滑膜组织取出后,一部分组织称重匀浆,进行细菌含量测定,另一部分滑膜组织进行组织学进行HE染色和革兰染色,评价组织中细菌情况以及炎症反应情况;同时通过应用XFA6030血液分析仪检测动物血液中感染相关炎症因子情况。结果:1.姜黄素在450nm激光照射下可产生活性氧,相同时间内呈现浓度依赖性,所有姜黄素组与阴性对照组相比均有统计学差异（P<0.001）;姜黄素浓度一定时,产生活性氧量随时间延长而增加,大约5 min后趋于稳定。在实验浓度范围内,姜黄素介导光动力杀伤MRSA作用明显,呈现浓度依赖性,以30μg姜黄素组在光照条件下对MRSA的杀伤作用最佳,MRSA菌存活率减少至（0.28±0.16）%。2.1我们通过水热法合成的上转换发光纳米颗粒在扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）下观察到纳米颗粒的粒径约为25nm,尺寸分布集中,基本为球形。在980nm近红外光激发下,上转换发光纳米颗粒能够产生450nm和475nm有两个发射峰。此外,上转换发光纳米颗粒的X射线衍射图显示示,在17°,29°,30°,43°的上转换发光纳米颗粒的主峰分别对应于NaYF4的标准卡片（JCPDS:16-0334）,说明上转换纳米粒子的成功合成,而且没有任何的杂相。姜黄素通过聚乙烯亚胺连接到上转换发光纳米颗粒上所形成的共轭复合物,尺寸约为200nm,粒径分布集中。此外,我们测试了姜黄素-上转换发光颗粒共轭复合物的Zeta电位为+19mV,MRSA细菌的Zeta电位是负值-32mV。2.2我们测得在980nm近红外光激发下姜黄素-上转换发光纳米颗粒共轭复合物的荧光发射峰分别位于450nm和475nm。与纯纳米颗粒的荧光谱相对比,我们可以看出连接姜黄素之前和之后,荧光谱的轮廓没有发生明显的变化,只是荧光发射强度发生明显减弱。再进一步的研究中,我们发现,连接上姜黄素之后共轭复合物的荧光寿命衰减变短,从纯颗粒的276.13μs到共轭复合物的186.83μs,同时进一步看出纯颗粒的荧光衰减为单指数衰减,而连接上姜黄素之后其衰减呈现为多指数衰减。这些实验结果证实姜黄素已经连接上在PEI上,而且激发态能级的能量是以能量传递的方式被姜黄素所接收,并且计算出能量传递效率为32.3%。2.3我们发现在相同980nm近红外光照射时间下,单线态氧的产生量随着姜黄素-上转换纳米颗粒共轭复合物的浓度增加而增加。随着照射时间的延长,产生的单线态氧浓度一开始迅速增加,在20min后增加速度逐渐减慢并趋于平缓。同时鼠前成骨细胞细胞的CCK-8实验显示24h共轭复合物组细胞生长良好,细胞呈长梭形或不规则形状,与空白对照物相比无显著差异,48 h照片显示的细胞密度相对24 h时要高,同样细胞呈现为长梭形,生长状态良好。并且将24 h、48 h测定的CCK-8吸光度OD值换算成RGR值,所得的RGR分级均为“0”或“1”级。2.4我们发现随着姜黄素-上转换纳米颗粒共轭复合物浓度的增加,对MRSA细菌的杀伤比例也随之增加。同一姜黄素-上转换纳米颗粒共轭复合物浓度下,随着照射时间增加,细菌杀伤比例也随之增加。共轭复合物浓度大于200μg/mL时,20min和30min所产生的细菌杀伤效果均接近100%。经计算得出姜黄素-上转换发光颗粒共轭复合物的最低抑菌浓度（MIC）为200μg/mL,后续照射时间采用20分钟。3.我们发现含有姜黄素的几个实验组对MRSA细菌均有杀伤效果,与阴性对照组区别明显,而且高浓度组（200μg/mL）姜黄素-上转换发光纳米颗粒共轭复合物加980nm近红外光光照时具有最好的杀菌效果。4.我们发现,在血液学以及滑膜细菌计数检测中,将阴性组与假手术组比较,所有三种细胞因子（IL-1β,IL-6和TNF-α）以及MRSA数量均显着增加,有980nm近红外光照射组的姜黄素-上转换发光纳米颗粒共轭复合物的治疗组细菌计数以及炎症因子情况均显着降低,尤其是在高剂量组（200μg/mL）中尤为明显。同时单纯姜黄素组也对MRSA具有一定的杀伤作用,并且它也可以减轻组织的炎症反应。组织学检测表明,在阴性组中发生大量炎性细胞,并且几乎在组织的同一部位也大量发现MRSA。相比于阴性对照组,单纯姜黄素组组织中细菌含量和炎症细胞聚集情况也有所减少,同时在两种姜黄素-上转换发光纳米颗粒组中,MRSA的量显著减少,炎细胞聚集明显减少,特别是在高剂量组（200μg/mL）中这种效果尤为明显。结论:（1）在450nm激光照射下,姜黄素能够产生活性氧,并且介导的光PDT作用能够对MRSA悬浮菌产生有效的清除作用,清除率接近100%（2）我们成功合成了上转换发光纳米颗粒,颗粒粒径分布均匀,结构稳定,元素组成纯正,带正电,更有利于被吸附到细菌表面,有利于光动力产生的单线态氧更好的发挥杀伤作用。同时我们通过共轭复合物的荧光光谱和姜黄素的吸收光谱以及荧光寿命衰减测定,发现连接上姜黄素之后,上转换发光颗粒能将吸收的近红外光传递给姜黄素使其发挥光-化学作用,为姜黄素发挥光动力作用提供了理论和实践基础。同时实验也说明我们合成的姜黄素-上转换发光颗粒共轭复合物细胞毒性低,能够应用于动物实验。（3）在体外实验中,我们的结果发现姜黄素本身对MRSA菌能够产生一定的杀伤作用,同时姜黄素-上转换纳米颗粒共轭复合物在980nm近红外光照射下介导PDT作用能够导致MRSA菌的大量杀伤,说明姜黄素在近红外光照射下能够通过双重抗菌作用对MRSA菌进行杀伤。（4）在动物体内实验中,我们发现980nm的近红外光能够有效穿透大鼠关节组织,激发关节腔内的姜黄素-上转换发光颗粒共轭复合物产生PDT作用,对MRSA进行清除,组织炎症情况也明显减轻,同时合并姜黄素本身的对MRSA的清除作用以及组织抗炎作用,急性MRSA型PJI动物在姜黄素-上转换发光颗粒共轭复合物的双重抗菌作用下能够得到有效的治疗,这为为假体周围感染治疗提供了一种新的可能的治疗方法,并且为光动力治疗假体周围感染提供了部分理论基础。