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本论文利用蝴蝶兰Phalaenopsis amabilis的原球茎和试管苗的幼叶为材料,研究了不同基本培养基、激素组合、椰子乳、蔗糖、创伤和高渗透压预处理、外植体大小等因素对类原球茎(protocorm-like body,PLB)诱导的影响,并对蝴蝶兰遗传转化体系进行了初步探索,得到如下主要研究结果:
1.1/4MS培养基是原球茎切片诱导PLB的最佳基本培养基。在培养基的添加物中,蔗糖对PLB诱导的影响最大,其次为椰子乳,再次为NAA和TDZ。原球茎切片在1/4MS+CM200 ml/L+SUC20 g/L+NAA0.5 mg/L+TDZ0.2 mg/L培养基上诱导PLB的效果最好。
2.在培养基中,TDZ单独使用,不能够诱导原球茎切片形成愈伤组织,NAA单独使用,能够诱导原球茎切片形成愈伤组织,但是诱导率很低,与TDZ配合使用,可以提高诱导率。
3.经创伤(横切2刀及刀尖扎15次)和高渗透压(0.4 mol/L甘露醇溶液或AAM培养基浸泡2 h)两类预处理后,叶片的PLB诱导率和平均PLB个数均极显著高于对照,叶片诱导出PLB的时间分别比对照提前了10 d和5 d。但来源于第一叶和第二叶的外植体之间的PLB诱导结果均没有明显差异。两类预处理均对叶片诱导PLB有显著促进作用,特别是创伤预处理,操作简单,效果较好。
4.切割方式和外植体大小均对叶片诱导PLB有显著影响。叶片经横切2刀和纵切2刀后,叶片PLB诱导率和平均每叶片诱导出的PLB数量均极显著高于对照,PLB形成时间均极显著短于对照,且横切处理的效果好于纵切;三分片段、六分片段、十二分片段的PLB诱导率均极显著高于对照,PLB形成时间均极显著短于对照。六分片段的PLB诱导率最高。
5.原球茎切片被农杆菌侵染后转化部位形成的第一代PLB多为转化嵌合体,完整原球茎被农杆菌侵染后转化部位为原球茎顶端的生长点或幼叶。
6.授粉后蝴蝶兰子房的生长发育表现为三个阶段:第一阶段为授粉第1 d到30 d,子房生长较快,第二阶段为授粉后30 d到70 d,子房继续生长,但生长速度慢于第一阶段,第三阶段为授粉70 d以后,子房停止生长。子房注射法可以转化蝴蝶兰胚珠得到转化种子,子房内壁的胎座组织也可以吸收外源质粒DNA。兰花