论文部分内容阅读
LRH-1(liver receptor。homologue-1)是首先在小鼠肝脏中发现的一个核受体蛋白,LRH-1在动物胚胎的早期发育及分化,维持成体动物胆固醇平衡,胆酸平衡等过程中起重要作用,对多种蛋白的正常表达起调控作用。最近的研究证实LRH-1在卵巢中有大量表达,且体外实验证明其可启动CYP19基因的表达。为进一步研究LRH-1在卵巢中的功能,本实验试图生产一种在卵巢中超量表达mLRH-1(mouse LRH-1)的转基因小鼠,用以研究该基因超量表达时对卵巢功能的影响。
本试验通过RT-PCR从小鼠肝脏反转录扩增出小鼠LRH-1基因的cDNA序列,并将其cDNA与GFP(Green Fluorescence Protein)基因的5端融合,使两个基因处在同一个阅读框内。然后通过体外同源重组将AMHR2(Anti-Mullerian Hormone Receptor type Ⅱ,抗缪勒氏管激素Ⅱ型受体)基因上游约13kb长的基因组片段"套取"下来,得到最终的转基因载体pAMHR2-LRH1-GFP。最后用NotⅠ和MluI双酶切pAmhr2-LRH1-GFP,得到一个15.4kb的转基因表达片段,该转基因片段从5到3端依次连有AMHR2启动子,LRHI-GFP融合基因及SV40 polyA加尾信号。细胞转染试验证明LRHI-GFF,融合基因可在HEK293细胞中正常表达。将表达片段通过原核注射导入FVB小鼠受精卵中,出生的小鼠通过聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction,PCR)及Southern杂交检测。PCR及Southern检测确定在24只后代中得到3只阳性小鼠。