论文部分内容阅读
玉米是我国最重要的粮食作物之一，镰孢菌（Fusarium spp.）能引起多种玉米土传病害，如苗枯病、根腐病、茎腐病和穗腐病等，造成严重的产量损失和品质下降。本文研究了我国玉米主产区田间土样的镰孢菌种群结构及优势致病种，针对镰孢属以及禾谷镰孢复合种建立实时荧光定量PCR检测体系，定量检测土样中镰孢菌的含量，研究了玉米苗枯病病情与土壤含菌量的关系。主要结果如下： 1.采用稀释涂布平板法，从全国17个省份的47份玉米田间土样中进行土壤镰孢菌分离，将得到58株镰孢菌进行单孢分离纯化，通过形态学、特异性引物以及ITS、TEF基因测序比对的方法，共鉴定出9种镰孢菌。其中，拟轮枝镰孢（F.verticillioides）（22.41%）、木贼镰孢(F.equiseti）（20.69%）、禾谷镰孢复合种（F.graminearum species complex）（18.97%）分离频率较高，为优势致病镰孢，其余6种镰孢菌包括尖镰孢复合种（F.oxysporum species complex）、锐顶镰孢(F.acuminatum)、层出镰孢（F.proliferatum）、单隔镰孢(F.dimerum)、茄镰孢（F.solani）、居群镰孢（F.commune）分离频率分别为12.07%、5.17%、8.62%、5.17%、3.40%、3.40%，从NCBI上下载标准菌株基因序列，利用MEGA 5.0软件采用最大似然法进行1000次自检构建系统发育树，结果显示相同镰孢菌与其参照菌株处于同一分支，不同区域的镰孢菌存在多样性。 2.基于镰孢菌属β微管蛋白(β-tubulin)序列，设计镰孢属特异性引物LB1/LB2，以各镰孢菌种及其他常见菌株进行普通PCR扩增检测其特异性，以系列稀释的镰孢菌DNA为模板，分别进行灵敏度检测和实时荧光定量PCR扩增。结果显示，8株不同镰孢菌菌株DNA均产生240 bp左右的目的条带，其余菌株无扩增，在模板浓度在10-3～102 ng/μL之间时呈现良好的线性关系，R2系数为0.9962，线性范围可达5个数量级，产物单一，无引物二聚体。 3.通过对禾谷镰孢甾醇14α-去甲基化酶基因CYP51C序列进行比对分析，设计出特异性引物HQ1-F和HQ1-R，对禾谷镰孢、层出镰孢、拟轮枝镰孢、尖镰孢和腐霉菌（Pythium spp.）等10种病原菌进行特异性扩增，结果显示仅禾谷镰孢扩增出目的条带。以禾谷镰孢DNA浓度梯度稀释作为标准品，建立实时荧光定量PCR（RT-qPCR）体系，结果表明溶解曲线具有单一吸收峰，扩增曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系，相关系数0.9968，扩增效率为104.7%，标准曲线为y=-3.2137x+34.956，DNA最低能检测浓度为1.0 pg/μL。 4. 通过土壤接种玉米苗枯病菌禾谷镰孢（F.graminearum）的室内盆栽试验，建立了单位土壤含菌量与接菌孢子浓度之间的线性关系，y=13.603x-85.37，相关系数0.9998，同时，构建了土壤检测菌量与玉米抗感自交系病情指数的相关曲线，可为病害发生与为害提供预警机制。利用建立的检测体系，针对玉米地土样的镰孢菌定量检测，结果显示镰孢菌属的含量在2.912~169.895pg/g范围，其中禾谷镰孢0.763~78.367pg/g，拟轮枝镰孢0.084~5.341pg/g。